ATAC-seq es una técnica poderosa para comprender los mecanismos reguladores de la expresión génica. Sin embargo, el tejido adiposo es difícil de usar esta técnica debido a su gran contenido de lípidos, alta contaminación mitocondrial y heterogeneidad celular. En este protocolo, la secuenciación ATAC específica de adipocitos se realizó utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia, que genera datos de alta calidad con una contaminación mínima del ADN mitocondrial.
Este método también se puede utilizar en otros tejidos donde las líneas de ratón Cre específicas del tipo de célula están disponibles con líneas reporteras transgénicas de etiquetado nuclear. Comience el aislamiento del núcleo enfriando los homogeneizadores de vidrio Dounce en hielo con un vidrio Dounce por muestra. Luego, agregue 7 mililitros de la mezcla NPB a cada vaso Dounce.
Luego, coloque de 50 a 100 miligramos de tejido adiposo congelado en el vaso y córtelo en algunos trozos más pequeños con un par de tijeras largas. Golpee 10 veces con un mortero suelto para todas las muestras, y luego 10 veces con un mortero apretado. Filtrar el contenido a través de un filtro de 100 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros antes de transferir los homogeneizados filtrados a un tubo de 15 mililitros para la centrifugación.
Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS-N golpeando suavemente pero minuciosamente los dedos. A continuación, filtre la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros en un tubo de 50 mililitros y enjuague el filtro con 250 microlitros de PBS-N. Transfiera la suspensión nuclear filtrada a una clasificación celular activada por fluorescencia o a un tubo FACS utilizando una micropipeta.
Prepare el tubo de recolección agregando 500 microlitros de PBS-N al nuevo tubo de 1.5 mililitros, e invierta varias veces para humedecer todas las superficies internas con el amortiguador. Gire brevemente los tubos para bajar todo el líquido antes de colocarlos en hielo hasta la clasificación. Para los FACS, utilice la puerta FSC-A/FSC-H para singletes y FSC-A/SSC-A para la remoción de desechos pequeños o grandes.
Puerta para la población de núcleos de adipocitos mCherry/GFP positivos, y recolectar 10, 000 núcleos en cada tubo de recolección preparado anteriormente. Para la preparación posterior a la clasificación del núcleo, agregue 500 microlitros de PBS-N a cada tubo de recolección y mezcle invirtiendo el tubo varias veces antes de centrifugar los tubos de recolección a 200 G durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Retire completamente el sobrenadante.
Para preparar 25 microlitros de mezcla maestra Tn5, mezcle 12.5 microlitros de tampón de ADN de etiquetado 2x o tampón TD, 1.25 microlitros de transposasa Tn5 o enzima TDE I y 11.25 microlitros de agua libre de nucleasa. A continuación, agregue 25 microlitros de mezcla maestra Tn5 a cada pellet de núcleo y vuelva a suspenderlo mediante un pipeteo suave. Incubar a 600 RPM durante 30 minutos a 37 grados centígrados utilizando un mezclador térmico.
Añadir 25 microlitros de agua libre de nucleasas a los 25 microlitros de la mezcla de resuspensión del núcleo Tn5 haciendo el volumen final de 50 microlitros. Luego, agregue 250 microlitros de tampón PB y 5 microlitros de acetato de sodio 3 M con pH 5.2. Después de transferir la mezcla a una columna provista con el kit de referencia, centrifugarla a 17, 900 G durante 1 minuto a temperatura ambiente.
Después de desechar el flujo continuo, vuelva a colocar una columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección. Agregue 750 microlitros de PE tampón que contenga etanol absoluto al tubo. Centrifuga la columna, desecha el flujo y vuelve a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección.
Centrifugar el tubo y desechar el tubo de recolección con el flujo continuo. Para amplificar los fragmentos de ADN transpuestos, prepare la mezcla maestra de PCR sin agregar un Ad2 único. n cartilla de código de barras.
Ejecute la PCR. Ejecute la PCR cuantitativa o qPCR. Verifique las curvas de amplificación e identifique el número de ciclos de PCR adicionales necesarios estimando el número de ciclos que alcanzaron aproximadamente el 35% del máximo.
Utilice los cálculos para ejecutar la PCR para los 45 microlitros restantes de la reacción de PCR. Usando los procedimientos anteriores, eluya los fragmentos de ADN amplificados con 20 microlitros de EB tampón. Transfiera el ADN eluyido a un nuevo tubo de PCR y ajuste el volumen a 100 microlitros agregando 80 microlitros de tampón EB. A continuación, agregue 55 microlitros de perlas SPRI y mezcle con pipeteo. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, sepárelo en un mini soporte magnético durante 5 minutos.
Una vez hecho esto, transfiera 150 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de PCR, agregue 95 microlitros de perlas SPRI y mezcle por pipeteo. Incubar la reacción durante 5 minutos antes de separar las perlas en el mini soporte magnético. Deseche el sobrenadante cuidadosamente y lave las perlas durante 1 minuto con 200 microlitros de etanol al 70%.
Repita dos lavados más. Después del lavado final, centrifugar los tubos a 1000 G durante 1 minuto. Pipetear el etanol restante y secar el pellet a 37 grados centígrados durante 2 minutos en una máquina de PCR con la tapa abierta.
Una vez seco, resuspender el pellet en 20 microlitros de tampón EB mediante pipeteo e incubar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente. Separe las perlas durante 5 minutos en el mini soporte magnético antes de transferir 18 microlitros del sobrenadante que contiene la biblioteca final a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Los núcleos de adipocitos marcados con mCherry y GFP se distinguieron de los otros tipos de núcleos celulares aislados de los tejidos adiposos de un ratón Adipoq-NuTRAP.
Dependiendo del tipo de depósito adiposo, la diferencia es de aproximadamente 50% en eWAT, 30% en iWAT y 65% en BAT se observaron en las fracciones de adipocitos. Las muestras que requirieron más de 15 ciclos de PCR indicaron muestras de baja calidad. El análisis de distribución de tamaños de las bibliotecas ATAC-seq demostró múltiples picos correspondientes a la región libre de nucleosomas, o NFR, y mono, di y multinucleosomas con tamaños promedio de aproximadamente 500 a 800 pares de bases.
Las muestras de mala calidad típicamente mostraron principalmente NFR con pocos o ningún pico nucleosómico. Las pruebas de control de calidad por el análisis qRT-PCR mostraron enriquecimientos de 10 a 20 veces con los elementos genómicos positivos cerca de los genes marcadores de adipocitos como Adipoq, Fabp4, Plin1 y Pnpla2, mientras que no se mostró enriquecimiento con el control negativo. El enriquecimiento con el gen termogénico Ucp1 se observó específicamente en BAT.
Las lecturas mitocondriales fueron inferiores al 2% y la fracción bajo los picos fue de aproximadamente 18% a 44%Se revelaron múltiples picos fuertes con altas relaciones señal-ruido cerca de genes marcadores de adipocitos como Adipoq, Fabp4 y Plin1 de todos los depósitos adiposos. Se observaron fuertes picos ATAC-seq en el marcador de adipocitos marrones Ucp1 locus en la muestra BAT. El factor más crítico para este protocolo es la calidad del núcleo.
Es importante utilizar muestras de tejido de alta calidad y manipular suavemente los núcleos durante todo el experimento, especialmente durante la resuspensión después de la centrifugación y clasificación. Es importante recordar que este protocolo se basa en ratones reporteros transgénicos con etiquetado nuclear. Aquí se utilizaron ratones NuTRAP, pero se puede usar cualquier sistema similar.
Con nuestros datos FACS, uno puede realizar análisis computacionales múltiples para encontrar factores transcriptómicos clave que regulan la expresión génica en entornos biológicos.
