El medido que se utiliza para realizar la secuenciación eficiente de ChIP de proteínas ésteres y no éster en el tejido lípido marrón aislado de ratón. La principal ventaja de la técnica es que el protocolo se ha optimizado para la inmunoprecipitación eficiente del complejo asociado a la cromatina desde el tejido lipídico. Antes de la incisión, rocíe el ratón eutanizado con 70%etanol.
Coloque el ratón con la espalda hacia arriba, luego haga una incisión a lo largo del cuello. A continuación, se encuentra BAT directamente debajo de la piel entre los hombros y eliminar cuidadosamente la fina capa de grasa blanca. Enlace cruzado de cada almohadilla BAT en 10 mililitros de PBS que contiene 1%formaldehído durante 15 minutos a 150 RPM a temperatura ambiente.
Después de 15 minutos, aprieta la reticulación mediante la adición de 2,5 glicina molar al BAT, lo que resulta en una concentración final de 125 milimolar. Colóquelo en una coctelera durante cinco minutos, girando a 150 RPM a temperatura ambiente. Posteriormente, transfiera la almohadilla BAT a 500 microlitros de tampón de lysis hipotónica y agregue dos perlas de acero inoxidable para cada almohadilla BAT.
Luego, usa un homogeneizador de tejido a base de cuentas para triturar el tejido. Comience con cinco minutos a máxima potencia. Si es necesario, extienda el tiempo hasta que el tejido se homogeneice y se separen las células individuales.
Transfiera la muestra a un tubo nuevo y centrifugar a cuatro grados centígrados a 16.000 G durante 10 minutos. Después de 10 minutos, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y mantenga el pellet celular sobre hielo. Centrifugar el sobrenadante a cuatro grados centígrados a 16.000 G durante 10 minutos para evitar la pérdida de células flotantes.
Luego, deseche el sobrenadante final y vuelva a suspender ambos pellets celulares juntos en 300 microlitros de tampón de lelisis SDS con un inhibidor de la proteasa una vez. Incubar sobre hielo durante 10 minutos. A continuación, sonicar los lysates para generar fragmentos de ADN de 200 a 500 pares base de largo.
Después de la sonicación, retire los escombros por centrifugación durante 10 minutos a 16.000 G a cuatro grados centígrados. Para realizar la inmunoprecipitación, mantenga el 1% de la solución de cromatina a un lado como la entrada ChIP y mantenga las entradas durante la noche en cuatro grados centígrados. A continuación, añada el anticuerpo ChIP a un mililitro de solución de cromatina y realice inmunoprecipitación paralela con el Correspondiente IgG preinmune o IgG normal de la misma especie.
Alternativamente, guarde un mililitro de solución de cromatina para un control sin anticuerpos. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación. Para recoger los complejos inmunológicos, añadir 50 microlitros de proteína A agarosa 50% lodo a los complejos inmunológicos e incubar durante una hora a cuatro grados Celsius con rotación a 150 RPM.
Después de una hora, peleciar las perlas por centrifugación durante un minuto a 1000 veces G a cuatro grados centígrados. Realice lavados secuenciales de las perlas en columnas de filtro centrífugo PVDF de 0,45 micrómetros con tampones de creciente rigurosidad transfiriendo primero las perlas en las columnas con 500 microlitros de tampón de lavado con bajo contenido de sal. A continuación, pelete las perlas en las columnas durante tres minutos a 2500 G.Deseche el flujo a través.
Repita el lavado con tampón de lavado con alto contenido de sal de acuerdo con los procedimientos de lavado con bajo contenido de sal. A continuación, repita los procedimientos con cloruro de litio y finalmente con una de las DOS. Una vez completados los lavados, eluía los complejos inmunes añadiendo 300 microlitros de tampón de elución a las perlas peletadas en las columnas. Incubarlos a temperatura ambiente durante 30 minutos en una coctelera a 400 RPM.
Posteriormente, recoger el elute girando hacia abajo las columnas durante tres minutos a 2500 G en un tubo fresco. Invierta los enlaces cruzados incubando el eluido y los insumos recogidos a 65 grados centígrados durante la noche. Para recuperar el ADN, agregue 300 microlitros de fenol cloroformo IAA al eluido y entradas en una relación uno a uno y vórtice durante 10 segundos.
A continuación, gire a 21.000 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Conservar el pellet y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet con un mililitro de etanol frío al 70%.
Luego gira a 21.000 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet. Vuelva a suspender el pellet en 70 microlitros de agua libre de DNAse para procedimientos adicionales.
Aquí está un ejemplo de ChIP Q PCR usando BAT aislado de ratón wildtype o GPS2-A knockout. Dado que se ha descubierto que el GPS2 es necesario para la expresión de genes mitocondriales codificados nuclearmente en diferentes líneas celulares, el reclutamiento de GPS2 se probó en dos genes mitocondriales codificados nuclearmente específicos. NDUFV1 y TOMM20 en BAT de ratones como los ejemplos de un tejido altamente enriquecido en las mitocondrias.
La ocupación del promotor gps2 se comparó en ratones nocaut GPS2-A y compañeros de letras de tipo salvaje. Se observó una disminución esperada en la unión GPS2 a genes selectivos en el BAT de ratones noqueados GPS2-A. Usando el protocolo descrito aquí, una mayor unión de ARN polimerasa dos y la marca de histona represiva, H3K9ME3, se registró en el BAT GPS2-A knockout ratones en comparación con las compañeras de letras de tipo salvaje.
Estos resultados confirman el reclutamiento de GPS2 en determinados genes mitocondriales codificados nuclearmente y muestran que el GPS2 es necesario para prevenir la acumulación de H3K9ME3 y, por lo tanto, se requiere para detener la actividad de la transcripción del polo dos en los promotores objetivo. El protocolo descrito aquí, incluso si está específicamente optimizado para el tejido adiposo marrón, representa una herramienta valorada para realizar ChIP de otro tejido murino y humano. No olvide que trabajar con fenocloroformo puede ser extremadamente peligroso.
Por lo tanto, es extremadamente importante operar siempre bajo la campana de humos mientras se utiliza este reactivo.
