Los autores desean agradecer a Mant Acon por las plantas utilizadas en este estudio. El financiamiento fue proporcionado por el proyecto CRIS 8062-22410-007-000-D del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la subvención NIFA del USDA 2020-70029-33176.

1. Producción de plantas de cítricos para inyección experimental de compuestos
<ol><li>Propague pequeños árboles de cítricos en macetas a partir de esquejes vegetativos enraizados o semillas. Cultivar las líneas de cítricos en maceta bajo una duración de día claro/oscuro de 16 h/8 h y a 28 °C.</li>
	<li>Seleccione plantas de cítricos del tamaño apropiado para el experimento. Las aplicaciones descritas requerían que las plantas tuvieran entre 12 cm y 100 cm de altura con diámetros de tronco de 4-14 mm. Si se requiere un nuevo crecimiento al ras, corte las plantas antes del experimento.</li>
</ol>2. Impresión tridimensional del dispositivo DPI y componentes del molde
<ol><li>Aplique una capa delgada de pegamento a base de acetato de polivinilo a la cama de impresión.</li>
	<li>Cargue filamento de nylon en la impresora 3D y prepare la impresora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Importe el archivo . STL (Archivo complementario 1, Expediente complementario 2, Archivo complementario 3, Expediente complementario 4, Expediente complementario 5, Archivo complementario 6, Expediente complementario 7, Expediente complementario 8, Expediente complementario 9, Expediente complementario 10, Archivo complementario 11, Archivo complementario 12, Expediente complementario 13 y Archivo complementario 14), configurar y comenzar a imprimir.</li>
	<li>Retire la pieza de la cama de impresión. Enjuague el pegamento a base de acetato de polivinilo de la base del componente impreso con agua y retire cualquier estructura de soporte.</li>
	<li>Rocíe el componente DPI con dos capas de pintura en aerosol brillante transparente.</li>
</ol>3. Fabricación del molde del anillo plastisol
<ol><li>Ensamble una forma de molde lo suficientemente grande como para sostener las piezas del patrón construyendo un recinto rectangular utilizando bloques de plástico a presión sobre una base (Figura suplementaria S1A).</li>
	<li>Mezcle el monómero de silicona RTV y el catalizador en una proporción de 10: 1, y revuelva sin introducir burbujas durante 1 minuto. Coloree agregando colorante alimentario (3 gotas/25 ml de mezcla de silicona) y jabón de manos (1 ml de jabón/25 ml de mezcla de silicona) (Figura suplementaria S1B).</li>
	<li>Vierta una capa delgada de silicona en la forma del molde que sea suficiente para cubrir completamente el fondo. Tamp para aplanar la superficie y esperar 24 h para que la silicona se fije (Figura suplementaria S1C).</li>
	<li>Vierta una segunda capa de silicona, como se describió anteriormente, que sea lo suficientemente profunda como para cubrir la impresión del núcleo del orificio central en el patrón (visible en la parte superior del patrón en la Figura Suplementaria S1D). Inserte el patrón en la silicona líquida con la impresión del núcleo del orificio central hacia abajo. Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas y que los patrones estén bien separados y no se toquen (Figura suplementaria S1E).</li>
	<li>Asegure los patrones con un objeto pesado y / o cinta adhesiva para evitar que floten fuera de la silicona mientras se asienta. Espere 24 h para que la capa recién vertida se fije (Figura suplementaria S1F).</li>
	<li>Vierta capas adicionales de silicona hasta que el nivel esté al ras con la parte superior del patrón. Esperar 24 h para curar (Figura Suplementaria S1G).</li>
	<li>Desmonte los bloques de plástico a presión para liberar el molde. Elimine los patrones (Figura suplementaria S1H). Inspeccione el molde en busca de desgarros o deformidades (Figura suplementaria S1I).</li>
</ol>4. Fundición de los anillos de plastisol
<ol><li>Cubra el interior del molde, todos los componentes principales y las juntas tóricas con aceite de cocina (Figura suplementaria S2A, B). Coloque una junta tórica alrededor de la muesca en el centro del núcleo del poste central y coloque el núcleo en el orificio central del molde del anillo de plastisol (Figura suplementaria S2C).</li>
	<li>Inserte el núcleo del canal de entrega en el orificio en el lado del molde del anillo de plastisol. Oriente la punta en forma de V al final del núcleo del canal de entrega para alinearla con la junta tórica en el núcleo del poste central (Figura suplementaria S2D,E).</li>
	<li>Calentar el plastisol en el microondas durante ráfagas cortas de 10 s (Figura suplementaria S2F, G). Revuelva el plastisol suavemente para evitar burbujas (Figura suplementaria S2H). Repetir el calentamiento y la agitación hasta que la solución alcance una temperatura entre 160 °C y 170 °C (Figura complementaria S2I). PRECAUCIÓN: El sobrecalentamiento del plastisol puede conducir a la liberación de humos tóxicos. Realice el procedimiento en un área bien ventilada o campana extractora. No caliente el plastisol a más de 170 °C.</li>
	<li>Vierta el plastisol fundido en el molde del anillo de plastisol cerca del borde exterior del molde sin introducir burbujas (Figura suplementaria S2J). Espere 1 h para que los anillos de plastisol se enfríen (Figura suplementaria S2K). Retire los anillos del molde. Asegúrese de que el dispositivo DPI se ajuste correctamente antes de usarlo en ensayos experimentales (Figura suplementaria S2L).</li>
</ol>5. Fijación del dispositivo DPI a la planta
<ol><li>Encuentre un sitio suave y saludable en el tronco para el accesorio del dispositivo. Evite cualquier golpe o nudo, ya que pueden contribuir a la fuga del dispositivo.</li>
	<li>Utilice una broca de 2 mm de diámetro para perforar un orificio horizontalmente a través del centro del vástago en un ángulo de 90° con la superficie del tronco (Figura suplementaria S3A). Pase la broca por el orificio varias veces para limpiarlo y alisarlo para crear un orificio sin obstrucciones (Figura suplementaria S3B).</li>
	<li>Cree una rebanada vertical en el anillo de plastisol en el lado opuesto del canal de suministro del compuesto (Figura suplementaria S3C). Coloque el anillo alrededor de la planta y alinee el canal de suministro con el orificio previamente perforado (Figura suplementaria S3D). NOTA: El anillo debe ajustarse perfectamente alrededor del maletero para evitar fugas; Los conjuntos de núcleos con varios diámetros se pueden usar para hacer anillos de plastisol para tallos de plantas de diferentes tamaños.</li>
	<li>Agregue el dispositivo DPI al anillo de plastisol, asegurándose de que encajen perfectamente. Alinee el pico del dispositivo DPI con el canal de suministro del anillo de plastisol y el orificio perforado (Figura suplementaria S3E). NOTA: El uso de una broca para alinear el orificio y el pico del dispositivo DPI puede ser útil.</li>
	<li>Envuélvase firmemente con cinta de silicona para mantener el aparato en su lugar (Figura suplementaria S3F). Inspeccione el dispositivo completamente ensamblado y conectado para garantizar la alineación y orientación adecuadas en la planta.</li>
</ol>6. Aplicación del compuesto de interés utilizando el dispositivo DPI
<ol><li>Utilice una jeringa o pipeta para llenar el dispositivo DPI con la solución de interés (Figura complementaria S3G). Utilice una jeringa para penetrar la cinta de silicona y el anillo de plastisol en el lado opuesto del dispositivo DPI para extraer el aire del canal interior y evitar la introducción de burbujas de aire en la vasculatura de la planta (Figura suplementaria S3H). Reemplace cualquier compuesto extraído de nuevo en el dispositivo DPI.</li>
	<li>Agregue un pequeño parche adicional de cinta de silicona sobre el orificio creado por la jeringa para reforzar el área y evitar desgarros. Inspeccione el aparato en busca de fugas visibles en el punto de fijación e inspeccione el depósito del dispositivo para un nivel de líquido estable. NOTA: El agua se puede usar inicialmente para detectar fugas y evitar el desperdicio de la solución de prueba.</li>
	<li>Cubra el extremo abierto del dispositivo DPI con una película de sellado de cera y tire hacia abajo para formar un sello y reducir la evaporación del compuesto experimental. Pinche un solo orificio en la película de cera con la punta de una jeringa para evitar el desarrollo de un vacío y, posteriormente, rellene el dispositivo (Figura suplementaria S3I).</li>
	<li>Revise el aparato diariamente para asegurar la alineación correcta de los componentes (Figura Suplementaria S3J), y llene el líquido con una jeringa para evitar que el depósito se seque. Repita este proceso hasta que se haya introducido la cantidad deseada de solución experimental. NOTA: Los compuestos se pueden introducir con éxito desde un dispositivo determinado durante un máximo de 1 mes. Las duraciones de absorción de la solución que excedan este marco de tiempo deben probarse empíricamente antes de la configuración experimental.</li>
</ol>7. Uso de CFDA para observar el movimiento vascular con plantas de cítricos
<ol><li>Conecte el dispositivo DPI a plantas de cidra (Citrus medica L.) de 25 cm de altura, aplique un solo tratamiento de 2.0 ml de DMSO al 20% en control deH2Oo CFDA al dispositivo DPI, y deje que absorba durante 24 h. Para seguir este protocolo, prepare la solución de CFDA de trabajo agregando 1,6 ml deH2Oa 400 μL de solución madre de CFDA (la solución madre contiene 10 mM de CFDA disuelto en 100% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para generar una concentración final de CFDA de 2 mM y 20% de DMSO.</li>
	<li>Haga secciones transversales de varios tejidos de la planta y use un microscopio estereoscópico o compuesto con un filtro fluorescente que incluya la longitud de onda de 498 nm para visualizar el CFDA en los tejidos vegetales. Compare las imágenes con el DMSO al 20% en los controles deH2Opara tener en cuenta la autofluorescencia en el tejido.</li>
</ol>8. Medición de los cambios en el título de CLas en muestras de hojas después del tratamiento con estreptomicina
<ol><li>Utilizando plantas de Valencia (Citrus sinensis (L .) Osbeck "Valencia") infectadas con CLas de 0,75 m de altura, recolecte el pecíolo y la nervadura central de dos hojas sintomáticas de HLB de cada planta, córtelas en pequeñas secciones, agrupe cada tipo de tejido y guárdelas por separado en tubos de muestra resistentes a los impactos de 2 ml que contienen una bola de acero de 6,35 mm de diámetro.</li>
	<li>Moler la muestra utilizando un homogeneizador programado para dos ciclos de 15 s a 3,4 m/s. Extraer el ácido nucleico total como se describió anteriormente19.</li>
	<li>Realizar qPCR en las muestras de hojas infectadas con CLas utilizando la mezcla de qPCR definida en la Tabla 1 y las condiciones de reacción definidas en la Tabla 2. Utilice plantas que muestren infecciones por CLas robustas (la infección robusta generalmente se define como valores de Ct basados en qPCR < 30 para el conjunto de cebadores CLas 16S LasLong (LL)) para un análisis adicional. NOTA: El título bacteriano se estima utilizando CLas 16S Las Long (LL) y cebadores de ADN de dehidrina cítrica para estimar los equivalentes relativos del genoma, como se describió anteriormente20.</li>
	<li>Equipe las plantas de cítricos que cumplan con el título mínimo de infección descrito anteriormente con dispositivos DPI y sométalas a un tratamiento único de 2.0 ml de solución deH2Oo solución de estreptomicina a la concentración deseada. Para seguir este estudio, use un solo tratamiento de 2.0 ml de 9.5 mg / ml (19 mg en total) de estreptomicina disuelta enH2O.</li>
	<li>Recoja muestras de hojas a los 7 días, 14 días y 28 días después del tratamiento. Analizar las hojas muestreadas para el título de CLas utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente.</li>
	<li>A los 60 días después del tratamiento, obtener fotografías de las plantas tratadas conH2Oo estreptomicina. Utilice observaciones visuales de la infección por CLas para calificar la gravedad de la infección. Busque el <50% de las hojas que muestran clorosis intervenal y taponamiento de las venas junto con el crecimiento del rubor de las hojas como signos de infección leve y más del 50% de las hojas con clorosis intervenal y taponamiento de venas, así como abscisión de las hojas y retraso en el crecimiento de la planta como signos de infecciones más graves.</li>
</ol>9. Medición de la mortalidad de D. citri tras el tratamiento con imidacloprid
<ol><li>Pode las plantas de cidra (Citrus medica L.) de 0,5 m de altura a una altura de 12 cm para fomentar el crecimiento de nuevas descargas. NOTA: La velocidad de crecimiento del enjuague puede depender de la salud de la planta y la época del año; Por lo tanto, tenga esto en cuenta durante el diseño experimental.</li>
	<li>Después de que se hayan desarrollado >6 enjuagues, de 1-2 cm de longitud, introduzca las plantas en jaulas que contengan D. citrri adulto. Deje las plantas en las jaulas durante 24 h para permitir la deposición de huevos.</li>
	<li>Realice recuentos representativos de huevos en tres brotes de lavado 1-2 días después de la puesta, y posteriormente aplique los dispositivos DPI. Llene estos dispositivos con 2.0 ml de un control de agua o la concentración deseada de imidacloprid (21.8% de ingrediente activo). Para seguir este protocolo, use 528 μL/L, 52.8 μL/L y 5.28 μL/L de imidacloprid. NOTA: Los recuentos de huevos son una medida destructiva, por lo que los recuentos en esta etapa se utilizan para estimar el número de huevos en el flujo no contado de la misma planta y ayudar a proporcionar una línea de base para los recuentos posteriores de emergencia de ninfas que se realizan al final del experimento.</li>
	<li>Recopile la tasa de emergencia de D. citri en al menos tres de los brotes restantes. Adquiera fotografías representativas de la planta 7 días después de la introducción del compuesto.</li>
</ol>

Liberación de moléculas en plantas mediante un dispositivo de infusión directa

<ol>
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Los autores no tienen conflictos de intereses. El uso de nombres comerciales, de empresas o corporaciones en esta publicación es para información y conveniencia del lector. Dicho uso no constituye un respaldo o aprobación oficial por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos o el Servicio de Investigación Agrícola de ningún producto o servicio con exclusión de otros que puedan ser adecuados. El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) prohíbe la discriminación en todos sus programas y actividades por motivos de raza, color, origen nacional, edad, discapacidad y, cuando corresponda, sexo, estado civil, estado familiar, estado parental, religión, orientación sexual, información genética, creencias políticas, represalias, o porque la totalidad o parte de los ingresos de un individuo se derivan de cualquier programa de asistencia pública. No todas las bases prohibidas se aplican a todos los programas. Las personas con discapacidades que requieren medios alternativos para la comunicación de la información del programa (Braille, letra grande, cinta de audio, etc.) deben comunicarse con el Centro TARGET del USDA al (202) 720-2600 (voz y TDD). Para presentar una queja de discriminación, escriba al USDA, Director, Oficina de Derechos Civiles, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, o llame al (800) 795-3272 (voz) o (202) 720-6382 (TDD). El USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades.

Para que el dispositivo DPI se considere un método viable para la administración de compuestos exógenos en las plantas, debe contribuir a una absorción de compuestos robusta y consistente en una variedad de tipos de tejidos. El experimento que utilizó CFDA mostró claramente el movimiento de compuestos acropetales y basípetos, así como tanto en el sistema vascular como en las células mesófilas de la hoja. Además, y presumiblemente porque el orificio perforado utilizado en este dispositivo DPI proporciona una gran cantidad de área de superficie para la absorción del compuesto, el CFDA estuvo presente en cantidades relativamente iguales en todas las secciones del tallo, no solo en un pequeño subconjunto de la vasculatura adyacente al dispositivo, como se ha visto en estudios previos de captación de tinte en plantas que usan inyección de tronco6. Además, se probó la entrega de proteína verde fluorescente y colorante floral utilizando el dispositivo DPI, y se observó una distribución de estos compuestos similar al CFDA (datos no mostrados). Estos datos sugieren que el dispositivo se puede utilizar para administrar sistemáticamente una variedad de compuestos que varían en tamaño y estructura molecular. Sin embargo, vale la pena señalar que hubo diferencias en la absorción del compuesto en función de la etapa de desarrollo de la hoja, con hojas en desarrollo más jóvenes que absorben más compuestos que las hojas establecidas más viejas. Esto puede deberse a los cambios en las propiedades de la vasculatura presentes en el sumidero frente al tejido fuente y debe optimizarse para un experimento dado. 
El dispositivo DPI mostró suficiente absorción de compuestos para la visualización de CFDA, GFP y colorante floral, y también tomó lo suficiente para mostrar los efectos antibacterianos e insecticidas de la estreptomicina y el imidacloprid, respectivamente. Ambos compuestos dieron lugar a cambios en la viabilidad del organismo diana 1 semana después de un solo tratamiento de 2,0 ml. Estos datos sugieren que el dispositivo DPI podría usarse en ensayos de plantas completas para probar la viabilidad de una amplia variedad de compuestos para el control de plagas microbianas e insectos. Además, debido a su contacto directo con el sistema vascular, este dispositivo puede incluso proporcionar la oportunidad de probar compuestos que no son absorbidos eficientemente por las raíces o las células epidérmicas. De particular interés sería la interferencia de ARN (ARNi), ya que podría usarse para modular la expresión génica dentro de la planta huésped, patógeno o vector patógeno. Investigaciones anteriores que introdujeron ARN horquilla a través de un agujero perforado en el tronco de las plantas de manzana y uva mostraron que las moléculas de ARN estaban restringidas al tejido del xilema, lo que sugiere que estas moléculas solo pueden ser efectivas contra los organismos que mastican y alimentan la savia del xilema22. Dado que el dispositivo DPI utiliza un sistema de administración de orificios perforados similar, es lógico pensar que el ARN de horquilla administrado con este dispositivo también puede estar restringido al tejido del xilema. Sin embargo, la disminución observada en el título de CLas limitados por floema después del tratamiento con estreptomicina del dispositivo DPI sugiere fuertemente que este antibiótico estaba presente en el floema. Por lo tanto, es probable que la distribución vascular de los compuestos administrados utilizando el dispositivo DPI dependa de su tamaño y química, y cada molécula debe evaluarse de forma individual.
Aunque hay una serie de dispositivos DPI disponibles comercialmente disponibles en el mercado, el dispositivo descrito aquí se puede fabricar internamente y es modificable. De esta manera, se pueden realizar mejoras y cambios de tamaño en función de la especie vegetal y el diseño experimental que se utiliza, y no depende de productos comerciales. Además, el dispositivo está conectado semipermanentemente a la planta, lo que significa que se pueden realizar múltiples tratamientos de un compuesto dado simultáneamente sin tener que volver a lesionar la planta con múltiples inyecciones de compuestos. En una nota de precaución, el dispositivo puede tener fugas si no se instala correctamente. Como resultado, el compuesto se pierde en el medio ambiente en lugar de ser entregado a la planta. Por lo tanto, se debe tener cuidado de inspeccionar el dispositivo para detectar cualquier signo de fuga durante la configuración y los primeros días después. Aunque perforar un agujero en el árbol es potencialmente dañino, este método fue elegido para garantizar una absorción de compuestos robusta y consistente. Además, no se observaron efectos adversos sobre la salud de las plantas a partir de la fijación del dispositivo DPI en estos experimentos. Sin embargo, se deben incluir plantas adicionales en el diseño experimental para reemplazar aquellas que pueden perder vigor a lo largo del curso de un experimento dado. Por último, dado que este dispositivo utiliza el flujo pasivo para introducir compuestos, puede ser difícil predecir la tasa de absorción en diferentes especies de plantas o etapas de desarrollo de la misma especie. Esto puede complicar los experimentos si la velocidad de absorción del compuesto es un factor limitante. Para obtener los mejores resultados, los experimentos deben planificarse de manera que se proporcione suficiente tiempo para que la planta absorba completamente los 2,5 ml de compuesto, lo que puede llevar hasta 1 semana. En conclusión, este dispositivo DPI es una herramienta eficaz para la evaluación rápida de la actividad en planta de compuestos antimicrobianos o insecticidas contra CLas y su vector, D. citri, proporcionando así más información sobre la efectividad sistémica y la influencia en el rendimiento de la planta que el ensayo de hoja desprendida presentado anteriormente23. Sin duda, la variedad de aplicaciones para este sistema va mucho más allá de los usos específicos descritos en este estudio.

El manejo de plantas en entornos comerciales y paisajísticos a menudo requiere el uso de compuestos químicos para optimizar el crecimiento y la salud de las plantas. La forma en que se entregan estas moléculas depende del tipo de molécula, la función de la molécula, el tipo de planta y el sistema de manejo establecido. Las aplicaciones foliares y de suelo son las estrategias de entrega más fáciles, pero las limitaciones en la absorción de algunas moléculas requieren la entrega directa. Un ejemplo de estas moléculas son las moléculas terapéuticas que funcionan mejor cuando se mueven sistémicamente dentro de la planta, pero no pueden ser entregadas eficazmente por aplicaciones tópicas simples1. Este es el caso de Huanglongbing (HLB), también llamado enfermedad del enverdecimiento de los cítricos. El HLB es una enfermedad asociada con una bacteria limitada por floema, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), que no puede cultivarse fuera de la planta, o su insecto vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Si las moléculas terapéuticas putativas son productos genéticos, pueden probarse creando plantas transgénicas que expresen estos compuestos. Sin embargo, la producción de plantas transgénicas puede requerir mucho tiempo y recursos, depende en gran medida del genotipo y puede inhibirse mediante el silenciamiento génico3. Además, incluso si estos transgénicos muestran resultados prometedores, las restricciones regulatorias y de percepción pública reducen la probabilidad de su aceptación comercial 4,5. La aplicación exógena de compuestos, sin embargo, simplifica la prueba de moléculas biológicas y sintéticas porque no requiere la producción de plantas transgénicas estables o que expresen transitoriamente, lo que reduce el tiempo y los recursos para probar los efectos de una molécula. Un método para la entrega sistémica efectiva y eficiente de compuestos exógenos a plantas podría usarse para una amplia variedad de propósitos de investigación y detección.
Una de estas aplicaciones es el análisis del movimiento sistémico de moléculas dentro del sistema vascular de una planta, que se puede hacer utilizando marcadores rastreables, ya sean isótopos químicos fluorescentes, visibles o únicos 6,7,8,9. Un marcador fluorescente comúnmente utilizado es el 5,6-carboxifluoresceína-diacetato (CFDA), que es un colorante permeable a la membrana que es degradado por esterasas intracelulares en 5,6-carboxifluoresceína (CF) y, posteriormente, se vuelve fluorescente e impermeable a la membrana10. El CFDA se ha utilizado ampliamente para monitorear el transporte del floema, las relaciones entre el sumidero y la fuente, y el patrón de vasculatura en el tejido vegetal11,12.
Además de estos marcadores, ciertos compuestos pueden alterar directamente la fisiología de la planta para aumentar la productividad o matar a la planta en el caso de los herbicidas. Tanto los insecticidas como los compuestos antimicrobianos son un medio para aumentar la productividad de las plantas, especialmente en presencia de HLB. Un ejemplo de una molécula antimicrobiana que se utiliza para controlar CLas es la estreptomicina. La estreptomicina es un antibiótico aminoglucósido que fue aislado originalmente de Streptomyces griseus y se ha demostrado que inhibe el crecimiento bacteriano a través de la inhibición de la biosíntesis de proteínas13. En términos de insecticidas, el objetivo principal de la investigación del HLB es D. citri, que transmite CLas de árbol a árbol14. Para este propósito, los neonicotinoides, como el imidacloprid, son comúnmente utilizados, ya que son el estándar de oro para el control de plagas de insectos15. Todos estos usos variados son aspectos importantes de las estrategias actuales de gestión de la planta, y el desarrollo de nuevos productos depende de ensayos de detección eficientes.
Un método que se utiliza para la introducción de compuestos en plantas leñosas es la inyección directa en el tronco. Se han diseñado una variedad de sistemas que varían en sus necesidades para sitios de inyección preperforados, y estos sistemas utilizan inyección basada en presión o flujo pasivo16. Aunque los sistemas basados en la presión permiten la introducción rápida de un compuesto dado, el daño físico potencial causado por forzar el líquido a través de la vasculatura bloqueada o embolizada debe considerarse17. Aunque la aplicación foliar o empapada de compuestos requiere menos tiempo de implementación, la inyección directa en la planta reduce el desperdicio del compuesto de interés debido a pérdidas en el aire o el suelo y también puede alargar el tiempo que los compuestos están en estado activo al reducir la exposición al ambiente exterior18. Ambos aspectos son importantes para preservar los reactivos costosos y garantizar la coherencia entre las réplicas en entornos de investigación.
Este estudio describe el diseño, la construcción y el uso de un innovador dispositivo de infusión directa de plantas (DPI), que se puede utilizar para evaluar cómo los compuestos de interés afectan a una planta huésped. Se utilizó una impresora 3D estándar para fabricar tanto el dispositivo en sí como varios componentes asociados con su construcción. Este método de construcción interno permite a los investigadores modificar el dispositivo y los componentes del dispositivo en función de sus necesidades experimentales específicas y reduce la dependencia de los dispositivos de inyección de planta disponibles comercialmente. La configuración del dispositivo es simple y eficiente, y todos los componentes auxiliares están disponibles y son económicos. Aunque el sistema fue diseñado para su uso con una variedad de especies de plantas, los ejemplos presentados aquí pertenecen a plantas de cítricos en macetas. Además, este estudio demuestra que este dispositivo es capaz de entregar de manera eficiente múltiples tipos de compuestos sistémicamente a las plantas jóvenes de cítricos sin causar letalidad. Los compuestos probados incluyeron CFDA, que se utilizó para evaluar la distribución del compuesto en la planta, y estreptomicina e imidacloprid, que se utilizaron para verificar que los efectos antimicrobianos e insecticidas de estos compuestos se observaron cuando se administraron a través de DPI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

Probar la función de los compuestos terapéuticos en las plantas es un componente importante de la investigación agrícola. Los métodos foliares y empapados de suelo son rutinarios pero tienen inconvenientes, incluida la absorción variable y la descomposición ambiental de las moléculas probadas. La inyección de troncos de árboles está bien establecida, pero la mayoría de los métodos para esto requieren equipos costosos y patentados. Para evaluar varios tratamientos para Huanglongbing, se necesita un método simple y de bajo costo para administrar estos compuestos al tejido vascular de pequeños árboles de cítricos cultivados en invernadero infectados con la bacteria limitada por floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) o infestados con el insecto vector CLas que se alimenta de floemas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
Para cumplir con estos requisitos de cribado, se diseñó un dispositivo de infusión directa de plantas (DPI) que se conecta al tronco de la planta. El dispositivo se fabrica utilizando un sistema de impresión 3D basado en nylon y componentes auxiliares fáciles de obtener. La eficacia de absorción del compuesto de este dispositivo se probó en plantas de cítricos utilizando el marcador fluorescente 5,6-carboxifluoresceína-diacetato. La distribución uniforme del marcador en todas las plantas se observó rutinariamente.
Además, este dispositivo se utilizó para administrar moléculas antimicrobianas e insecticidas para determinar sus efectos sobre CLas y D. citri respectivamente. El antibiótico aminoglucósido estreptomicina se administró en plantas de cítricos infectadas con CLas utilizando el dispositivo, lo que resultó en una reducción en el título de CLas de 2 semanas a 4 semanas después del tratamiento. La administración del insecticida neonicotinoide imidacloprid en plantas de cítricos infestadas de D. citri resultó en un aumento significativo en la mortalidad de psílidos después de 7 días. Estos resultados sugieren que este dispositivo DPI representa un sistema útil para entregar moléculas a las plantas para pruebas y facilitar la investigación y la detección.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

Autor destacado: Dispositivo de infusión directa para la administración de moléculas en plantas  

Dispositivo de infusión directa para la administración de moléculas en plantas

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

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Este manuscrito describe un novedoso dispositivo de infusión directa de plantas para evaluar la efectividad de moléculas contra la bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) o su insecto vector (Diaphorina citri, Kuwayama) que, en combinación, están asociadas con la enfermedad de los cítricos de Huanglongbing.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Entregar una molécula terapéutica a donde reside un patógeno en una planta puede ser un desafío. El tratamiento de Candidatus Liberibacter asiaticus, o CLas, una bacteria que se limita al floema, plantea uno de los mayores desafíos en la entrega de moléculas contra él, especialmente cuando se utilizan métodos convencionales como las aplicaciones de pulverización. La facilidad de impresión del dispositivo de infusión directa de planta y su sencilla implementación lo hace accesible a cualquier persona.Esto permite el cribado generalizado de moléculas por su potencial efecto terapéutico en los árboles. Un beneficio adicional es que la difusión de moléculas utiliza el proceso natural de transpiración de las plantas. Nuestra investigación mejoró la eficiencia y la precisión de la entrega molecular en las plantas, que se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones de investigación.Al examinar cientos de moléculas en plantas pequeñas, podemos eliminar la necesidad de árboles más grandes, lo que lleva a una reducción en el costo y la utilización del espacio.

direct-infusion-device-for-molecule-delivery-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

1.3K vistas.  United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory. Entregar una molécula terapéutica a donde reside un patógeno en una planta puede ser un desafío. El tratamiento de Candidatus Liberibacter asiaticus, o CLas, una bacteria que se limita al floema, plantea uno de los mayores desafíos en la entrega de moléculas contra él, especialmente cuando se utilizan métodos convencionales como las aplicaciones de pulverización. La facilidad de impresión del dispositivo de infusión directa de planta y su sencilla implementación lo hace accesible ...

Video: Autor destacado: Dispositivo de infusión directa para la administración de moléculas en plantas  

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Investigación

Biología

﻿3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings

3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings  

To begin 3D printing the direct plant infusion or DPI device and mold components, apply a thin layer of polyvinyl acetate-based glue on the print bed of the printer. Load nylon filament into the printer and prepare the printer per the manufacturer's instructions. After importing the desired STL files, set up the printer and start printing.Once the piece is removed from the print bed after printing, rinse the polyvinyl acetate-based glue from the base of the printed component with water. Spray the printed DPI device and other components with two coats of clear gloss spray paint. To fabricate the plastisol ring mold, assemble a mold form by building a rectangular enclosure using snap-together plastic blocks on a base.It should be large enough to hold the pattern pieces. Mix the room temperature vulcanizing silicone or RTV silicone monomer and the catalyst together at a 10:1 ratio by stirring for one minute. Color the solution by adding three drops of food coloring and one milliliter of hand soap per 25 milliliters of silicone mixture.Then, pour a thin layer of the silicone solution into the mold form sufficiently to fully cover the bottom of the mold form. Tamp to flatten the surface of the poured silicone, and wait for 24 hours to set the silicone. Once the silicone is set, pour another layer of silicone deep enough to cover the center hole core print of the pattern.Insert the pattern into the liquid silicone with the center hole core print facing down. Ensure that no bubbles are trapped and the patterns are well separated and not touching each other. Secure the patterns with either a heavy object or tape to prevent them from floating out of the silicone while it sets.Once set, pour additional layers of silicone into the mold form until the level is flush with the top of the pattern. Let the silicone cure for 24 hours. Disassemble the snap-together plastic blocks to release the mold.Then, remove the patterns from the mold and inspect the mold for tears or deformities. For casting the plastisol rings, coat the interior of the mold, all the core components, and the O-rings with cooking oil. Place an O-ring around the notch in the middle of the center post core, and place the core in the center hole of the plastisol ring mold.Insert the delivery channel core into the space on the side of the plastisol ring mold. Orient the V-shaped tip at the end of the delivery channel core to align with the O-ring on the center post core. Next, heat plastisol in the microwave for short bursts of 10 seconds till the solution reaches 160 to 170 degrees Celsius.In between, stir the plastisol gently to avoid bubbles. Pour the molten plastisol into the plastisol ring mold near the outside edge of the mold without introducing bubbles. Wait one hour for the plastisol rings to cool.Then, remove the rings from the mold. The DPI device was eight centimeters in height and three centimeters in width. It had a single central reservoir contiguous with the spout.The total volume that can be contained within these components is 2.0 milliliters. The 1.8 centimeter tall and 2.7 centimeter wide plastisol ring also contained two channels. One to accommodate the DPI device spout and another of variable diameter for fitting around the trunk of the tree.When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree.

Impresión 3D de dispositivo de infusión directa de planta (DPI) y fabricación de anillos de plastisol

Attachment of the Direct Plant Infusion (DPI) Device to Citrus Plants for Compound Injection

Propagate small potted citrus trees from rooted vegetative cuttings or seeds. Grow the potted citrus lines at 28 degrees Celsius, maintaining a proper day length. Select citrus plants of the appropriate size for the experiment.To attach the 3D-printed Direct Plant Infusion or DPI device to the trunk of the plant, find a smooth, healthy site on the trunk without bumps or knots. Using a two-millimeter-diameter drill bit, horizontally drill a hole through the center of the stem at an angle of 90 degrees to the trunk surface. Run the drill bit through the hole several times to create an unobstructed, smooth hole.Then create a vertical slice in the plastisol ring on the opposite side of the compound delivery channel. Fit the ring around the plant, aligning the delivery channel with the previously-drilled hole. Attach the DPI device to the plastisol ring, ensuring they fit snugly together, and align the DPI device spout with the plastisol ring delivery channel and the drilled hole.Wrap it tightly with silicone tape to hold the apparatus in place. Inspect the fully assembled and attached device to ensure proper alignment and orientation. The groove around the vertical channel allowed additional compound uptake through the bark.When assembled properly, the plastisol ring flushed against the DPI device and the spout lined up with a hole drilled in the tree.

Fijación del dispositivo de infusión directa de plantas (DPI) a plantas de cítricos para inyección de compuestos

Applying Compounds to Citrus Plants Using a Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion (DPI) Device

To apply compounds to the plants using the Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion, or DPI device, ensure the device is properly fitted to the plants. When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree. Use a syringe or pipette to fill the DPI device with the compound solution of interest.Using a syringe, penetrate the silicone tape and plastisol ring opposite to the DPI device to extract air from the interior channel. Replace any extracted compound back into the DPI device. Add an additional small patch of silicone tape over the hole created by the syringe to reinforce the area and prevent tears.Inspect the apparatus for visible leakages at the attachment point and inspect the device reservoir for a stable liquid level. Cover the open end of the DPI device with a wax sealing film and pull it down to form a seal to reduce the evaporation of the experimental compound. Poke a single a hole in the wax film with a syringe tip to prevent the development of a vacuum, and subsequently refill the device.Check the apparatus daily to ensure proper alignment of the components, and top off the liquid using a syringe to avoid the reservoir running dry til the desired amount is delivered. When two milliliters of two millimolar CFDA dye was introduced to the plant using the DPI device, a fluorescent signal was detected in the vasculature of the treated plant, but was absent in the controlled plant treated with 20%DMSO in water. This signal was observed within 24 hours of treatment, evenly throughout the dissected plant tissue types.Treatment of streptomycin on Candidatus Liberibacter Asiaticus or CLass positive plants showed a reduction in the mean bacterial titer to 28 days after treatment compared to the control. The treated plants showed a lower mean CLas titer over all combined time points. The streptomycin treated plants as compared to the controls showed an occasional increase in new healthy flush growth after 60 days.Imidacloprid treatment on plants significantly reduced nymph emergence at the highest Imidacloprid concentration compared to the corresponding egg count. This was visually apparent in the reduction in nymph honeydew production.