Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el número de proyecto ZIA BC 010329.

NOTA: Este ensayo se realiza en celdas de 293 pies. Una línea epitelial bien caracterizada y fácilmente transfectable derivada de células embrionarias de riñón humano. Una sola placa de cultivo confluente de 10 cm de estas células suele proporcionar suficientes células para sembrar 20 pocillos de placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Los pasos 1 a 3 deben realizarse utilizando técnica estéril en una cabina de seguridad biológica.
1. Siembra de células (Día 1)
NOTA: En este paso, las células se separan de la(s) placa(s) de cultivo de tejidos, se cuentan y se siembran en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos para la transfección en el paso 2 (Figura 2).
<ol><li>Aspire el medio de las células en el plato de 10 cm. Lave las células con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y aspire.</li>
	<li>Añadir 1 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 3-5 min a 37 °C para separar las células de la placa.</li>
	<li>Añada 9 mL del medio eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM) a las células para neutralizar la tripsina y pipetee hacia arriba y hacia abajo repetidamente para generar una suspensión unicelular homogénea.</li>
	<li>Transfiera inmediatamente 20 μL de células a un tubo de 1,7 mL y mezcle con 20 μL de tinción de azul de tripano. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado (Tabla de materiales) o un hemocitómetro.</li>
	<li>Diluya las células a 2 x 105 células/ml en un medio DMEM completo y añada 2 ml a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos (4 x 105 células/pocillo). Incubar las células a 37 °C y 10% de CO2 durante la noche. NOTA: Se recomienda utilizar celdas de 293 pies que hayan pasado menos de 20x. Hemos encontrado previamente que el uso de celdas con un mayor número de pasajes puede resultar en una reducción de las proporciones BRET y una mayor variabilidad de la señal de pozo a pocillo.</li>
</ol>2. Transfección celular (Día 2)
NOTA: Aquí, las células se transfectan con las construcciones de expresión pCMV5-NanoLuc-CRAF y pCMV5-14-3-3ζ-Halo, junto con el vector vacío pCDNA3.1 (Figura 2).
<ol><li>Antes de la transfección, diluir los plásmidos N-BRET a 5 ng/μL y pCDNA3.1 a 100 ng/μL, y numerar un juego de tubos estériles de 1.7 mL.</li>
	<li>Agregue 100 μL de medio de transfección (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) a cada tubo, junto con 5 ng de pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng de pCMV5-14-3-3ζ y 200 ng de PCDNA3.1.</li>
	<li>Añada 2 μL de reactivo de transfección (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y vórtice suavemente para mezclar. Centrifugar los tubos por pulsos brevemente en una microcentrífuga para asegurarse de que todo el líquido se recoge en el fondo de los tubos y, a continuación, incubar a unos 25 °C durante 15 minutos.</li>
	<li>Añadir complejos de transfección gota a gota a las células e incubar a 37 °C/10% CO2 durante 16-20 h para permitir que se expresen las proteínas marcadas con Halo y Nano. NOTA: La adición de un vector vacío (pCDNA3.1) de ADN portador es esencial para lograr una alta eficiencia de transfección de las construcciones de expresión de N-BRET. La falta de adición de vector vacío da lugar a niveles reducidos de expresión de las proteínas 14-3-3ζ-Halo y Nano-CRAF y, a su vez, da lugar a proporciones BRET débiles e inconsistentes, como se ha comentado anteriormente22.</li>
</ol>3. Rechapado de células (Día 3)
NOTA: En este paso, las células se transfieren a una placa de 384 pocillos y el ligando Halo 618 (+ligando; Tabla de Materiales) o DMSO (+vehículo) para leer las emisiones BRET en el paso 4. Las células restantes se transfieren a placas de cultivo frescas de 6 pocillos para el análisis de Western blot en el Paso 5 (Figura 2).
<ol><li>Reúna los siguientes materiales y prepare el área de trabajo como se describe a continuación.<ol><li>Usando un baño de agua a 37 °C, precaliente la tripsina-EDTA, junto con los medios de ensayo sin suero y los medios de ensayo suplementados con un 10% de FBS (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).</li>
		<li>En función del número de muestras que se van a medir, etiquete previamente tres juegos de tubos estériles de 1,7 ml (juego 1-3) y un juego de tubos estériles de fondo cónico de 15 ml. Equipe una centrífuga de cubo oscilante con insertos de tubo de 15 mL y preenfriamiento a 4 °C.</li>
		<li>Coloque los siguientes elementos en la campana de cultivo de tejidos: depósitos de reactivos, placas de cultivo de tejidos de 384 pocillos, placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos, una pipeta y puntas multicanal, portaobjetos/cámaras de recuento de células y tinción de azul de tripán (Tabla de materiales), junto con los juegos de tubos 1-3 de 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Coseche y cuente las celdas como se describe a continuación.<ol><li>Aspire el medio de las placas de 6 pocillos y agregue 250 μL de tripsina-EDTA a las células. Incubar las placas de 6 pocillos a 37 °C hasta que las células comiencen a desprenderse (3-5 min).</li>
		<li>Agregue 1 ml de medio de ensayo suplementado con FBS al 10% a cada pocillo para neutralizar la tripsina y pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para generar una suspensión unicelular.</li>
		<li>Transfiera 1 mL de la suspensión celular a los tubos de 15 mL preetiquetados. Agregue otro 1 mL de medio de ensayo suplementado con FBS al 10% a cada uno de los tubos de 15 mL.</li>
		<li>Invierta los tubos 5 veces para mezclar y transfiera inmediatamente 20 μL de suspensión celular al juego de tubos 1.</li>
		<li>Centrífuga en la centrífuga de cubeta oscilante preenfriada durante 5 minutos a ~250 x g. Durante la etapa de centrifugación, mezcle 20 μL de tinción de células de azul de tripano con las células del juego de tubos 1 y luego cuente las células usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Es típico un rendimiento de 6-8 x 105 células/mL.</li>
		<li>Retire los tubos de 15 ml de la centrífuga y aspire los medios de los gránulos de la celda. Vuelva a suspender los gránulos celulares a 2 x 105 células/ml en un medio de ensayo sin suero y pipetee enérgicamente para generar una suspensión de una sola célula. NOTA: El uso de medios de ensayo sin suero se utiliza para poner en modo inactivo las vías normales de señalización celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Vuelva a colocar las celdas en placas de 384 pocillos y 6 pocillos como se describe a continuación.<ol><li>Invierta los tubos de 15 ml varias veces para asegurar una suspensión celular homogénea y transfiera 500 μL a los tubos de 1,7 ml del juego 2 y del juego 3.</li>
		<li>Añada 0,5 μL de DMSO (+vehículo) al conjunto 2 y 0,5 μL de ligando Halo 618 (+ligando) al juego de tubos 3 y pipetea para mezclar.</li>
		<li>Transfiera las suspensiones de celdas +vehículo y +ligando a pozos separados de depósitos de reactivos. Utilizando la pipeta multicanal (Tabla de materiales), transfiera 40 μL de la suspensión de celda +vehículo desde los depósitos de reactivos a los pocillos cuadruplicados de la placa de cultivo de 384 pocillos. Repita este paso para las suspensiones de células +ligando.</li>
		<li>Transfiera las células restantes a placas de cultivo frescas de 6 pocillos. Incubar las placas de 384 pocillos y 6 pocillos durante la noche a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lectura de las emisiones BRET (Día 4)
NOTA: En este paso, el sustrato de nanoluciferasa (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) se agrega a las células en la placa de cultivo de 384 pocillos y se leen las emisiones del aceptor N-BRET (618 nm) y del donante (460 nm) (Figura 2). A continuación, se calculan los ratios BRET corregidos.
<ol><li>Precalentar los medios de ensayo sin suero en un baño de agua a 37 °C y descongelar el sustrato de nanoluciferasa a 25 °C. Diluir el sustrato de nanoluciferasa 1:100 en un medio de ensayo sin suero y transferir a un depósito de reactivo. Prepare suficiente cantidad de esta mezcla para agregar 10 μL a cada pocillo de la placa de 384 pocillos, más un 10%-15% de volumen adicional.</li>
	<li>Utilizando una pipeta multicanal (Tabla de Materiales), transfiera 10 μL de la mezcla de sustrato a cada uno de los pocillos que contienen células en la placa de cultivo de 384 pocillos. Gire suavemente la placa durante 1 minuto, ya sea manualmente o con un agitador orbital.</li>
	<li>Inserte la placa de 384 pocillos en el lector de placas multimodo y registre las emisiones de 460 nm y 618 nm para todos los pocillos que contienen celdas. NOTA: Para el lector de placas multimodo utilizado para este paso (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), se utilizó una altura de lectura de 6,5 mm, con una medición de tiempo de lectura de 0,1 s, sin embargo, puede ser necesaria una mayor optimización si se utilizan otros lectores de placas.</li>
	<li>Calcule las proporciones BRET brutas para +vehículo y +ligando en unidades miliBRET (mBU) individualmente, utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66436/66436eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Calcule la relación BRET corregida restando la relación BRET +vehículo de la del +ligando (Tabla suplementaria 1). NOTA: Al comparar los resultados de múltiples experimentos, las proporciones BRET corregidas se pueden agrupar y normalizar al promedio del par N-BRET de tipo salvaje (WT), que consta de Nano-CRAFWT y 14-3-3ζWT-Halo (Tabla suplementaria 1).</li>
</ol>5. Confirmación de los niveles de expresión proteica (Días 4 y 5)
NOTA: En este paso, las células de las placas de 6 pocillos se lisan y los niveles de expresión proteica de las proteínas Nano-CRAF y 14-3-3ζ-Halo se determinan mediante análisis de Western blot utilizando anticuerpos específicos para las etiquetas Halo y Nano. (Figura 2).
<ol><li>Añadir inhibidores de la proteasa y la fosfatasa al tampón de lisis NP40 (Tabla de materiales), lo que permite 200 μL de tampón de lisis por muestra.</li>
	<li>Aspire los medios de las placas de 6 pocillos que contienen células. Lavar las celdas una vez con 1 mL de PBS frío y aspirar.</li>
	<li>Añadir 125 μL de tampón de lisis NP40 a cada pocillo e incubar placas de 6 pocillos a 4 °C en una plataforma oscilante durante 15 min para lisar las células.</li>
	<li>Transfiera los lisados a tubos de 1,7 ml sobre hielo y centrifuga a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C. Vuelva a colocar los lisados aclarados en hielo y determine la concentración de proteínas utilizando ensayos disponibles comercialmente, como los ensayos de Bradford o de ácido bicinconínico (BCA).</li>
	<li>Normalice la concentración de proteínas en todas las muestras transfiriendo un volumen adecuado de lisado y tampón de lisis NP40 a tubos nuevos de 1,7 ml hasta un volumen total de 100 μl.</li>
	<li>Hervir 5 veces el tampón de muestra de proteínas (Tabla de materiales) durante 1 minuto y añadir 25 μL a cada muestra. Hervir las muestras durante 5-6 minutos y luego centrifugar los tubos por pulsos brevemente para asegurarse de que toda la muestra se acumule en la base del tubo.</li>
	<li>Cargue 25 μL de muestra en cada pocillo de geles de proteínas duplicados (Gel 1 y Gel 2) y luego transfiera las proteínas a membranas de nitrocelulosa o PVDF utilizando procedimientos estándar de Western blot, como se describió anteriormente22.</li>
	<li>Bloquee las membranas en BSA-PBS al 3% a 25 °C durante 30 min y luego incube las membranas durante la noche con el anticuerpo Halo (dilución 1:1,000; Gel 1) y anticuerpo nanoluciferasa o CRAF (dilución 1:500; Gel 2) en solución salina tamponada con tris, suplementado con Tween-20 al 0,2% (TBST; Tabla de Materiales).</li>
	<li>Lave las membranas 1 vez durante 5 min en 10 mL de TBST y luego incube a temperatura ambiente durante 1 h con el anticuerpo secundario HRP anti-ratón, diluido 1:10.000 en TBST.</li>
	<li>Lave las membranas 3 veces en una plataforma oscilante en 10 mL de TBST a 25 °C durante 5 min cada una. Retire el TBST y visualice las bandas de proteínas utilizando reactivos ECL y un procesador de película de rayos X u otro sistema de imagen adecuado.</li>
</ol>

Análisis de interacción CRAF-14-3-3 en células vivas utilizando un enfoque basado en BRET

<ol>
	<li>Blasco, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Raf,+but+not+B-Raf,+is+essential+for+development+of+K-Ras+oncogene-driven+non-small+cell+lung+carcinoma.">c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma.</a> Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).</li><li>Blasco, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+regression+of+advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+upon+combined+inhibition+of+EGFR+and+C-RAF.">Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF.</a> Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).</li><li>Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Raf+is+required+for+the+initiation+of+lung+cancer+by+K-Ras(G12D).">C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D).</a> Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).</li><li>Lito, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CRAF-mediated+MEK+activation+is+required+for+effective+MEK+inhibition+in+KRAS+mutant+tumors.">Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors.</a> Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).</li><li>Sanclemente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-RAF+ablation+induces+regression+of+advanced+Kras/Trp53+mutant+lung+adenocarcinomas+by+a+mechanism+independent+of+MAPK+signaling.">c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling.</a> Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).</li><li>Razzaque, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+gain-of-function+mutations+in+RAF1+cause+Noonan+syndrome.">Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).</li><li>Terrell, E. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-mediated+activation+of+the+Raf+family+kinases.">Ras-mediated activation of the Raf family kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).</li><li>Kondo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+dimeric+B-Raf:14-3-3+complex+reveals+asymmetry+in+the+active+sites+of+B-Raf+kinases.">Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases.</a> Science. 366, 109-115 (2019).</li><li>Park, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+autoinhibited+and+active+BRAF-MEK1-14-3-3+complexes.">Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes.</a> Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).</li><li>Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+14-3-3+protein+is+an+essential+cofactor+for+Raf+kinase+activity.">A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity.</a> Nature. 394, 88-92 (1998).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RASopathy+mutations+provide+functional+insight+into+the+BRAF+cysteine-rich+domain+and+reveal+the+importance+of+autoinhibition+in+BRAF+regulation.">RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation.</a> Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).</li><li>Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+BRAF+monomer-to-dimer+transition+mediated+by+RAS+binding.">Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding.</a> Nat Commun. 13, 486 (2022).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Raf+dimerization+in+cell+signaling.">The importance of Raf dimerization in cell signaling.</a> Small GTPases. 4, 180-185 (2013).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Raf+dimerization+and+its+inhibition+on+normal+and+disease-associated+Raf+signaling.">Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling.</a> Mol Cell. 49, 751-758 (2013).</li><li>Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O'Neill, E., Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+role+of+Raf-1/B-Raf+heterodimerization.">Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization.</a> Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Mol Cell. 20, 963-969 (2005).</li><li>Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-Raf+and+Raf-1+are+regulated+by+distinct+autoregulatory+mechanisms.">B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms.</a> J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).</li><li>Chong, H., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Raf+through+phosphorylation+and+N+terminus-C+terminus+interaction.">Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction.</a> J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).</li><li>Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+the+Raf-1+serine/threonine+kinase.">Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).</li><li>Park, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+RAS/RAF+recruitment+complex.">Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex.</a> Nat Commun. 14, 4580 (2023).</li><li>Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+measuring+BRAF+autoinhibition+in+live+cells+using+a+proximity-based+NanoBRET+assay.">Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay.</a> STAR Protoc. 4, 102461 (2023).</li><li>Clark, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+zeta+negatively+regulates+raf-1+activity+by+interactions+with+the+Raf-1+cysteine-rich+domain.">14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain.</a> J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).</li><li>Machleidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBRET--A+novel+BRET+platform+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions.">NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions.</a> ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).</li><li>Hekman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+C-Raf+phosphorylation+and+14-3-3+protein+binding+in+response+to+growth+factor+stimulation:+differential+roles+of+14-3-3+protein+binding+sites.">Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites.</a> J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464, 431-435 (2010).</li><li>Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+the+measurement+of+Raf-1+kinase+activity.">A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity.</a> Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+facilitates+Ras-dependent+Raf-1+activation+in+vitro+and+in+vivo.">14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).</li><li>Durrant, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+NanoBRET+screening+platform+to+identify+modulators+of+the+RAS/RAF+interaction.">Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction.</a> Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).</li></ol>

Nada que revelar.

Estudios previos han demostrado que las proteínas 14-3-3 desempeñan un papel fundamental tanto en la activación como en la inhibición de las quinasas RAF. Comprender cómo se regulan estos eventos de unión y los efectos de la modulación de estas interacciones en la señalización de RAF y la oncogénesis impulsada por RAF puede descubrir nuevas vulnerabilidades terapéuticas que se dirigen a la función de CRAF. Sin embargo, el ciclo de activación de Raf está respaldado por una gran cantidad de proteínas asociad...

Las quinasas RAF (ARAF, BRAF y CRAF) son los efectores directos de las GTPasas RAS y los miembros iniciadores de la cascada de quinasas RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-supervivencia. Estudios recientes han demostrado que la expresión de CRAF desempeña un papel clave en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el adenocarcinoma ductal de páncreas 1,2,3,4,5. Además, las mutaciones de la línea germinal en CRAF causan una forma particularmente grave de la RASopatía (síndrome de Noonan) 6,7. Comprender la regulación del CRAF es fundamental para desarrollar enfoques terapéuticos exitosos que se dirijan a su función en las células.
Todas las quinasas RAF se pueden dividir en dos dominios funcionales, un dominio catalítico C-terminal (CAT) y un dominio regulador N-terminal (REG), que controla su actividad (Figura 1A)8. El dominio REG abarca el dominio de unión RAS (RBD), el dominio rico en cisteína (CRD) y una región rica en serina/treonina (rica en S/T). En particular, la región rica en S/T contiene el sitio N', que se une a 14-3-3 de una manera dependiente de la fosforilación (S259 en CRAF; Figura 1A) 8. El dominio CAT abarca el dominio quinasa, junto con un segundo sitio de acoplamiento 14-3-3 de alta afinidad, denominado sitio C' (S621 en CRAF; Figura 1A) 8. La unión diferencial de las proteínas diméricas 14-3-3 a los sitios N' y C', junto con la CRD, desempeña un papel crítico tanto en la activación como en la inhibición de RAF 9,10,11,12,13. En condiciones normales de señalización, la activación de RAF se inicia mediante su reclutamiento a la membrana plasmática por RAS, lo que le permite formar dímeros activos, de los cuales el heterodímero BRAF-CRAF es la forma activa predominante14,15. Los ensayos bioquímicos con BRAF y CRAF, junto con estructuras de microscopía electrónica criogénica (Cryo-EM) de BRAF dimérico, indican que un dímero 14-3-3 estabiliza los dímeros activos de RAF al unirse simultáneamente al sitio C' de ambos protómeros de RAF (Figura 1B)9,13,16,17. Por el contrario, los estudios han demostrado que, en condiciones de reposo, la RAF adopta una confirmación citosólica autoinhibida, donde el dominio REG se une al dominio CAT e inhibe su actividad 12,18,19,20. Este estado cerrado se estabiliza mediante un dímero 14-3-3 unido al sitio CRD y N' en el dominio REG y al sitio C' en el dominio CAT (Figura 1B)10,13,21. En BRAF, este modelo está respaldado por estructuras Cryo-EM recientes de monómeros BRAF autoinhibidos y por nuestros estudios bioquímicos previos 10,12,13,21,22. Sin embargo, mientras que se ha demostrado que el 14-3-3 desempeña un papel inhibidor en la regulación23 del CRAF, un estado autoinhibido similar al BRAF puede desempeñar un papel menor en la regulación12 del CRAF; por lo tanto, se requieren más estudios para aclarar los mecanismos por los cuales las proteínas 14-3-3 regulan la actividad de CRAF. La regulación mediada por 14-3-3 de las quinasas RAF requiere una gran cantidad de eventos de fosforilación y desfosforilación de RAF, la unión a varias proteínas reguladoras e interacciones con la membrana plasmática8. Por lo tanto, es fundamental que las interacciones de 14-3-3-RAF se midan en condiciones fisiológicamente relevantes y en presencia de una bicapa lipídica intacta.
Para abordar este problema, se utilizó la tecnología NanoBRET (en adelante denominada N-BRET; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles del kit) para desarrollar un ensayo basado en la proximidad para medir las interacciones de CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas (Figura 1C). Este sistema basado en BRET mide las interacciones de dos proteínas de interés (POI), donde una proteína se marca con un donante de nanoluciferasa (Nano) y la otra con una etiqueta Halo, para su marcaje con el ligando aceptor de energía Halo61822,24. La interacción de las proteínas de interés da como resultado la transferencia de energía del donante al aceptor, que a su vez genera la señal BRET (Figura 1C). La proteína donante Nano extremadamente brillante (emisión (em) 460 nm) y el ligando Halo618 (em 618 nm) proporcionan una mayor separación espectral y sensibilidad que el BRET convencional, lo que lo convierte en una plataforma ideal para estudiar interacciones más débiles y detectar cambios sutiles en la unión24. De hecho, previamente desarrollamos un ensayo basado en N-BRET para medir las interacciones autoinhibitorias de los dominios RAF REG y CAT, que fue esencial para la caracterización de un panel de mutaciones de RASopathy en el BRAF CRD y demostró la importancia crítica de este dominio para mantener la autoinhibición y prevenir la activación constitutiva de BRAF12.
El ensayo descrito aquí mide las interacciones de CRAF, fusionado con una etiqueta Nano N-terminal (Nano-CRAF), y la isoforma zeta de 14-3-3 fusionada con la etiqueta Halo C-terminal (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Demostramos que las interacciones de Nano-CRAF con 14-3-3ζ-Halo generan una señal BRET robusta, que a su vez puede ser interrumpida por mutaciones que impiden la unión de 14-3-3 al sitio N' (S259A) y/o al sitio C' (S621A). El siguiente protocolo proporciona pasos detallados para realizar, optimizar y solucionar problemas de este ensayo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211&#160;</td>
			<td>Antibody for detecting HaloTag tagged&#160; proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td>Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRAF mouse monoclonal antibody (E10)&#160;</td>
			<td>Santa Crus Biotechnology</td>
			<td>sc-7267</td>
			<td>Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931-1ML&#160;</td>
			<td>Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE&#8482; 9</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>6365809001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBRET&#8482; kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1661&#160;</td>
			<td>NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca++ and Mg++&#160;</td>
			<td>Quality Biologicals&#160;</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995073</td>
			<td>High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium&#160; pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#8482; I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum media, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Trypan Blue Stain&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>T10282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 lysis buffer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,&#160; NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 &#181;M leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x gel sample buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells (human)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>R70007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-14-3-3&#950;-Halo&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision 2104 Multimode Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer 2104</td>
			<td>2104-0010&#160;</td>
			<td>600LP NanoBRET &#38; M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,&#160; Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Countess&#8482; II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMQAX1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher E1-ClipTip&#8482;&#160; Multichannel&#160; Pipettor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>4672070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (version 10.0.3)&#160;</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>94410153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1228K16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer 384-well CulturPlate&#8482;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007680</td>
			<td>White, polystyrene, tissue culture treated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence resonance energy transfer (bret)-based assay for measuring interactions of craf with 14-3-3 proteins in live cells

El CRAF es un efector primario de las GTPasas RAS y desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS. Además, el CRAF es un punto caliente para las mutaciones de la línea germinal, que se ha demostrado que causan la RASopatía del desarrollo, síndrome de Noonan. Todas las quinasas RAF contienen múltiples sitios de unión dependientes de la fosforilación para las proteínas reguladoras 14-3-3. La unión diferencial de 14-3-3 a estos sitios desempeña un papel esencial en la formación de dímeros activos de RAF en la membrana plasmática en condiciones de señalización y en el mantenimiento de la autoinhibición de RAF en condiciones de reposo. Comprender cómo se regulan estas interacciones y cómo se pueden modular es fundamental para identificar nuevos enfoques terapéuticos que se dirijan a la función de la RAF. Aquí, describo un ensayo basado en la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas. En concreto, este ensayo mide las interacciones de CRAF fusionado con un donante de nanoluciferasa y 14-3-3 fusionado con un aceptor de etiquetas Halo, donde la interacción de RAF y 14-3-3 da lugar a la transferencia de energía de donante a aceptor y a la generación de la señal BRET. El protocolo muestra además que esta señal puede ser interrumpida por mutaciones que se ha demostrado que evitan la unión de 14-3-3 a cada uno de sus sitios de acoplamiento RAF de alta afinidad. Este protocolo describe los procedimientos para sembrar, transfectar y replantear las células, junto con instrucciones detalladas para leer las emisiones de BRET, realizar análisis de datos y confirmar los niveles de expresión de proteínas. Además, se proporcionan ejemplos de resultados de ensayos, junto con pasos de optimización y solución de problemas.

RAF kinases (ARAF, BRAF, and CRAF) are the direct effectors of RAS GTPases and the initiating members of the pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade. Recent studies have shown that CRAF expression plays a key role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers, including non-small cell lung cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma1,2,3,4,5. Moreover, germline CRAF mutations cause a particularly severe form of the RASopathy, Noonan syndrome6,7. Understanding CRAF regulation is critical for developing successful therapeutic approaches that target its function in cells.
All RAF kinases can be divided into two functional domains, a C-terminal catalytic (CAT) domain and an N-terminal regulatory (REG) domain, that controls its activity (Figure 1A)8. The REG domain encompasses the RAS binding domain (RBD), the cysteine-rich domain (CRD), and a serine/threonine-rich region (S/T-rich). Notably, the S/T-rich region contains the N&#39; site, which binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner (S259 in CRAF; Figure 1A)8. The CAT domain encompasses the kinase domain, along with a second high-affinity 14-3-3 docking site, referred to as the C&#39; site (S621 in CRAF; Figure 1A)8. The differential binding of dimeric 14-3-3 proteins to the N&#39; and C&#39; sites, along with the CRD, plays critical roles in both RAF activation and inhibition9,10,11,12,13. Under normal signaling conditions, RAF activation is initiated by its recruitment to the plasma membrane by RAS, allowing it to form active dimers, of which the BRAF-CRAF heterodimer is the predominant active form14,15. Biochemical assays with BRAF and CRAF, along with cryogenic electron microscopy (Cryo-EM) structures of dimeric BRAF, indicate that a 14-3-3 dimer stabilizes active RAF dimers by binding simultaneously to the C&#39; site of both RAF protomers (Figure 1B)9,13,16,17. Conversely, studies have shown that under quiescent conditions, RAF adopts a cytosolic, autoinhibited confirmation, where the REG domain binds to the CAT domain and inhibits its activity12,18,19,20. This closed state is stabilized by a 14-3-3 dimer bound to the CRD and N&#39; site in the REG domain and to the C&#39; site in the CAT domain (Figure 1B)10,13,21. In BRAF, this model is supported by recent Cryo-EM structures of autoinhibited BRAF monomers and by our previous biochemical studies10,12,13,21,22. However, while 14-3-3 is shown to play an inhibitory role in CRAF regulation23, a BRAF-like autoinhibited state may play a lesser role in CRAF regulation12; therefore further studies are required to clarify the mechanisms by which 14-3-3 proteins regulate CRAF activity. The 14-3-3-mediated regulation of RAF kinases requires a plethora of RAF phosphorylation and de-phosphorylation events, the binding to various regulatory proteins, and interactions with the plasma membrane8. Therefore, it is critical that 14-3-3-RAF interactions are measured under physiologically relevant conditions and in the presence of an intact lipid bilayer.
To address this issue, NanoBRET (from here on referred to as N-BRET; see Table of Materials for kit details) technology was utilized to develop a proximity-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells (Figure 1C). This BRET-based system measures the interactions of two proteins of interest (POI), where one protein is tagged with a nanoluciferase (Nano) donor and the other with a Halo tag, for labeling with the Halo618 energy acceptor ligand22,24. Interaction of the proteins of interest results in donor to acceptor energy transfer, which in turn generates the BRET signal (Figure 1C). The extremely bright Nano donor protein (emission (em) 460 nm) and the Halo618 ligand (em 618 nm) provide greater spectral separation and sensitivity over conventional BRET, making it an ideal platform for studying weaker interactions and detecting subtle changes in binding24. Indeed, we previously developed a N-BRET-based assay for measuring the autoinhibitory interactions of the RAF REG and CAT domains, which was essential for the characterization of a panel of RASopathy mutations in the BRAF CRD and demonstrated the critical importance of this domain for maintaining autoinhibition and preventing constitutive BRAF activation12.
The assay described here measures the interactions of CRAF, fused to an N-terminal Nano tag (Nano-CRAF), and the zeta isoform of 14-3-3 fused to C-terminal Halo tag (14-3-3&#950;-Halo; Figure 1C). We show that the interactions of Nano-CRAF with 14-3-3&#950;-Halo generates a robust BRET signal, which can in turn be disrupted by mutations which prevent 14-3-3 binding to the N&#39; site (S259A) and/or the C&#39; site (S621A). The following protocol provides detailed steps for performing, optimizing, and troubleshooting this assay.

Autor destacado: Integración de ensayos basados en BRET y análisis de mutaciones raras para descifrar la regulación de la quinasa RAF en células vivas

Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

The primary focus of our research is to uncover new vulnerabilities in the Ras-MAPK kinase pathway through the study of rare disease associated mutations within. We recently developed another BRET-based assay for measuring the auto inhibitory activities of RAF kinases in live cells. Importantly, this assay was essential for characterizing a group of rare germline mutations in the BRAF cysteine rich domain, which demonstrated the critical importance of this domain for maintaining BRAF auto inhibition and for preventing constitutive BRAF biological activity.This assay measures the interactions of 1433 proteins with the RAF kinase CRAF, and these interactions play essential roles in mediating RAF function in both development and disease. In addition, this assay combined with previously established assays for measuring RAF auto inhibition and the RAF-RAF interaction form the basis of a toolkit for dissecting the regulatory mechanisms of RAF kinases in live cells.

Cuando se realiza como se describe en este protocolo (Figura 2), la interacción de Nano-CRAFWT y 14-3-3ζ-Halo debería producir proporciones BRET corregidas de 50-60 mBU (Figura 3A; Cuadro complementario 1). CRAF contiene dos sitios de acoplamiento 14-3-3 dependientes de fosforilación, el sitio N' y el sitio C' (Figura 1)8. Por lo tanto, los controles apropiados para reducir la ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Integrating BRET-Based Assays and Rare Mutation Analysis to Decipher RAF Kinase Regulation in Live Cells at JoVE.com

Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

El objetivo principal de nuestra investigación es descubrir nuevas vulnerabilidades en la vía de la quinasa Ras-MAPK a través del estudio de las mutaciones asociadas a enfermedades raras en su interior. Recientemente hemos desarrollado otro ensayo basado en BRET para medir las actividades autoinhibitorias de las quinasas RAF en células vivas. Es importante destacar que este ensayo fue esencial para caracterizar un grupo de mutaciones germinales raras en el dominio rico en cisteína BRAF, lo que demostró la importancia crítica de este dominio para mantener la autoinhibición de BRAF y para prevenir la actividad biológica constitutiva de BRAF.Este ensayo mide las interacciones de 1433 proteínas con la quinasa RAF CRAF, y estas interacciones desempeñan un papel esencial en la mediación de la función RAF tanto en el desarrollo como en la enfermedad. Además, este ensayo, combinado con ensayos previamente establecidos para medir la autoinhibición de RAF y la interacción RAF-RAF, forman la base de un conjunto de herramientas para diseccionar los mecanismos reguladores de las quinasas RAF en células vivas.

bioluminescence-resonance-energy-transfer-bret-based-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

640 vistas.  Medical University of South Carolina. El objetivo principal de nuestra investigación es descubrir nuevas vulnerabilidades en la vía de la quinasa Ras-MAPK a través del estudio de las mutaciones asociadas a enfermedades raras en su interior. Recientemente hemos desarrollado otro ensayo basado en BRET para medir las actividades autoinhibitorias de las quinasas RAF en células vivas. Es importante destacar que este ensayo fue esencial para caracterizar un grupo de mutaciones germinales raras en el dominio rico en cisteína BRAF, ...

Video: Autor destacado: Integración de ensayos basados en BRET y análisis de mutaciones raras para descifrar la regulación de la quinasa RAF en células vivas

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

Investigación

Bioquímica

Transfection of 293FT Cells with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo Expression Constructs

To begin, take 293FT cells cultured in a 10 centimeter dish, and aspirate the media. Wash cells with five milliliters of PBS. Then add one milliliter of trypsin EDTA, and incubate for 3-5 minutes at 37 degrees Celsius to detach cells from the dish.After incubation, add nine milliliters of complete DMEM to the cells to neutralize the trypsin. Pipette up and down repeatedly to generate a homogenous single cell suspension, and transfer the cells to a 15 milliliter tube. Immediately transfer 20 microliters of cells to a 1.7 milliliter tube, and mix with 20 microliters of trypan blue stain.Count cells using either an automated cell counter or a hemocytometer. Transfer the appropriate volume of cells to a 50 milliliter tube, and dilute in complete DMEM. Add two milliliters of cell suspension to each well of a six-well plate.Incubate cells at 37 degrees Celsius and 10%carbon dioxide overnight. Prior to transfection, dilute nanoluciferase CRAF and 1433 zeta halo plasmids, along with a pCDNA3 empty vector in TE buffer. Label a set of sterile 1.7 milliliter tubes.Add 100 microliters of transfection media to each tube, along with the expression constructs. Now add two microliters of transfection reagent, and vortex gently to mix. Pulse spin the tubes briefly in a microcentrifuge, and then incubate the tubes at around 25 degrees Celsius for 15 minutes to allow transfection complexes to form.Afterwards, add transfection complexes to cells dropwise, and incubate at 37 degrees Celsius for 16-20 hours to express the halo and nanotagged proteins.

Transfección de células 293FT con construcciones de expresión de pCMV5-NanoLuc-CRAF y pCMV5-14-3-3ζ-Halo

Preparing 293FT Cells Transfected with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo for BRET Emission Assay

To begin, label three sets of sterile 1.7-milliliter tubes and one set of sterile 15-milliliter conical bottom tubes. Prepare a swing bucket centrifuge with 15-milliliter tube inserts and pre-cool to four degrees Celsius. Take the six-well cell culture plate with transfected 293FT cells.Aspirate the media from the wells. Add 250 microliters of trypsin-EDTA and incubate at 37 degrees until cells begin to detach. Then add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each well and pipette vigorously to create a single-cell suspension.Transfer one milliliter of cell suspension to pre-labeled 15-milliliter tubes. Add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each of these tubes and invert five times to mix. Then immediately transfer 20 microliters of cell suspension to tube set one.Now centrifuge the 15 milliliter tubes for five minutes at 250 g in a pre-cooled centrifuge. Mix 20 microliters of trypan blue cell stain with cells in set one and count using a cell counter or hemocytometer. After removing the 15-milliliter tubes from the centrifuge, aspirate media from cell pellets and resuspend pellets in serum-free assay media to create a single-cell suspension.To reflate cells in 384-well and six-well plates, invert the 15-milliliter tubes several times for a homogenous cell suspension and transfer 500 microliters to 1.7 milliliter tubes in set two and set three. Add 0.5 microliters of DMSO to set two and 0.5 microliters of Halo 618 ligand to tube set three and mix well. Transfer the DMSO and ligand-positive cell suspensions to separate wells of reagent reservoirs.Use a multi-channel pipette to transfer 40 microliters of each suspension to the 384-well culture plate. Transfer the remaining cells to fresh six-well culture plates for subsequent western blot analysis and incubate both 384-well and six-well plates overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Take serum-free assay media prewarmed at 37 degrees Celsius.Dilute the thawed nanoluciferase substrate 1:100 in serum-free assay media and transfer it to a reagent reservoir. Using a multi-channel pipette, transfer 10 microliters of substrate mixture to each well of the 384-well culture plate. Gently rotate the plate for one minute.Insert the 384-well plate into a multi-mode plate reader and record the 460 and 618 nanometers emissions from all wells with cells. Calculate the raw BRET ratios for vehicle-positive and ligand-positive in milliBRET units using the given equation. Calculate the corrected BRET ratio by subtracting the vehicle-positive BRET ratio from that of the ligand-positive.The nano-CRAFS259A mutant reduces the BRET signal by approximately 45%and the nano-CRAFS621A mutant by around 25%The double mutant nearly eliminates the BRET signal.