Las células T son células inmunitarias que protegen nuestro cuerpo de las enfermedades infecciosas y el cáncer. El timo es un órgano que produce células T y selecciona las células T en desarrollo de acuerdo con los componentes propios del cuerpo. Estamos interesados en cómo el timo produce y selecciona células T que son protectoras para nuestro cuerpo y, sin embargo, tolerantes para el cuerpo.
Nuestro laboratorio ha contribuido al análisis de las células epiteliales tímicas, que tienen un papel clave en la producción y selección de células T en el timo. El análisis a nivel de célula única de las células epiteliales tímicas nos ha ayudado a comprender mejor el mecanismo molecular del desarrollo y la selección de las células T. Las células epiteliales tímicas son muy diversas con estructuras complejas, lo que dificulta su aislamiento.
La tecnología actual para aislar suspensiones unicelulares es limitada y necesita mejoras. Aun así, el aislamiento unicelular de las células epiteliales tímicas mejora nuestra comprensión de la maquinaria molecular involucrada en su desarrollo y función. Esperamos que nuestro estudio contribuya a la comprensión de la generación y regeneración de células inmunitarias.
Creemos que servirá como una piedra angular importante para el avance de la salud humana. Después de recolectar el timo del ratón, colóquelo en cinco mililitros de RPMI 1640 que contienen 10 milimolares HEPES en un plato de plástico de 60 milímetros con hielo. Bajo un microscopio de disección, use pinzas curvas de punta fina para eliminar la sangre, el timo y los tejidos grasos.
Corta el timo en trozos pequeños con unas tijeras de disección. Transfiera los trozos de timo a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de un miligramo por mililitro de colagenasa y dispasa, y una unidad por mililitro de DNasa en RPMI 1640 que contenga 2% de FBS. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, mezcle la suspensión con una pipeta de transferencia de plástico de tres mililitros y continúe incubando durante aproximadamente 30 minutos o hasta que no se vean los fragmentos de tejido. Agregue cinco mililitros de EDTA cinco milimolares en HBSS que contengan 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros.
Centrifugar la suspensión a 350 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y volver a suspender el pellet en 10 mililitros de tampón FACS. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas. Después de recolectar el timo de un ratón neonatal, use pinzas curvas de punta fina para eliminar la sangre, el timo no timo y los tejidos grasos.
Transfiera el timo a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 0,2 mililitros de RPMI 1640 que contenga 10 milimolares de HEPES. Con una pipeta de 200 microlitros, deseche el medio, luego agregue 0,5 mililitros de 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa y dispasa y una unidad por mililitro de Dnasa en RPMI 1640 que contiene 2% de FBS. Incubar el tubo en un bloque de calor a 37 grados centígrados.
Durante la incubación, mezcle suavemente con una pipeta de un mililitro. Después de 10 minutos, agregue 0,5 mililitros de EDTA cinco milimolares en HBSS que contenga 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 micras en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Agregue nueve mililitros de RPMI 1640 que contiene 10 milimolares HEPES al tubo. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y resuspender el pellet en uno a tres mililitros de tampón FACS. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
Para empezar, agregue 16 veces 10 a la potencia de 6 células de timo de ratón neonatales o postnatales en un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 microlitros de concentración de trabajo de anticuerpo monoclonal anti-receptor FC en tampón FACS.
Incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Agregue 40 microlitros de cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-CD45, anticuerpo monoclonal anti-EpCAM, anticuerpo monoclonal anti-Ly-51 y UEA-1 en tampón FACS. Mezclar el contenido de un tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 45 minutos.
Después de la incubación, agregue dos mililitros de tampón FACS. Centrifugar la suspensión celular a 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y volver a suspender el pellet en un microlitro de solución violeta 510 de Ghost Dye. Mezclar el contenido de un tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
Ahora agregue dos mililitros de tampón FACS y centrifugue la suspensión celular antes de fijar las celdas con un mililitro de aldehído paraformado al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agregue 3,5 mililitros de PBS al tubo. Centrifugar la suspensión celular a 700G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados y permeabilizar las células con un mililitro de tampón de fijación intracelular y permeabilización.
Mezclar el contenido de un tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, centrifugar la suspensión celular y agregar un mililitro de tampón de permeabilización. Nuevamente, centrifugue la suspensión, antes de agregar 100 microlitros de cada una de las concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-beta5t o del anticuerpo anti-CCL21.
Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Añadir un mililitro de tampón de permeabilización y centrifugar la suspensión celular a 700G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Ahora agregue 100 microlitros de concentraciones de trabajo de IgG anti-conejo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de agregar el tampón de permeabilización, centrifugar la suspensión celular. Vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón FACS y mezcle bien. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 micras antes del análisis de citometría de flujo.
Los perfiles de citometría de flujo de células de timo digeridas por colagenasa y dispasa de ratones de cero días y ratones de dos semanas demostraron que más del 90% de las señales de partículas representaban células viables. Las señales fluorescentes de las células viables fueron representadas por CD45 y EpCAM. Durante las etapas neonatales, los cTEC fueron más frecuentes que los mTEC, pero después del nacimiento, los mTEC dominaron debido a la baja eficiencia de liberación de cTEC.
La fijación y permeabilización de las células permite la detección de moléculas intracelulares dentro de las TEC. La expresión de Beta5t se detectó en la mayoría de los cTEC, pero no en los mTEC. CCL21 se detectó en una fracción de mTEC, pero no en cTEC.
En comparación, el aire se expresó en una subpoblación de mTEC.
