Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Se combinaron diferentes métodos de microscopía óptica para obtener información sobre los diversos pasos en la entrega de nanopartículas desde la superficie de las microburbujas hasta el medio circundante. Se realizaron imágenes de las oscilaciones de burbujas, así como imágenes de la liberación de las nanopartículas de la capa de burbujas, la extravasación y la penetración a través de la matriz extracelular de tumores in vivo. Las imágenes in vitro permiten la detección de muchos parámetros de ultrasonido en comparación con las configuraciones in vivo más complejas. El beneficio de combinar esta gama de modalidades de imágenes es la información complementaria que se puede obtener en diferentes escalas de tiempo, una característica que es crucial para caracterizar y optimizar las microburbujas para una entrega exitosa y para obtener eficacia terapéutica. Este enfoque es útil para comprender los mecanismos de administración de todas las microburbujas por igual, incluidas las construcciones con nanopartículas y medicamentos marcados con fluorescencia.
Los pasos más críticos en los métodos de microscopía utilizados para estudiar microburbujas individuales son los siguientes. Para la microscopía de fluorescencia, las nanopartículas deben estar marcadas fluorescentemente para permitir la visualización de la liberación de partículas. Además, la solución de muestra debe diluirse lo suficiente como para aislar microburbujas individuales para su análisis en métodos de microscopía confocal, de campo brillante y de fluorescencia. Además, es importante elegir una frecuencia de conducción por ultrasonido y presión acústica para excitar las burbujas de la manera más eficiente, es decir, en su resonancia. Si la pregunta de investigación se refiere a la entrega de la carga útil de nanopartículas, los parámetros de ultrasonido apropiados deben ser parte de la investigación. Junto a la resonancia, estas burbujas también deben ser conducidas en o más allá de su umbral para la liberación de nanopartículas, típicamente a amplitudes de presión acústica relativamente altas (MI > 0.3)51. Para las imágenes de microscopía de campo brillante, es fundamental elegir una cámara de alta velocidad con una velocidad de fotogramas lo suficientemente alta como para minimizar el desenfoque de movimiento y evitar el aliasing.
La microscopía de campo brillante está limitada principalmente por la velocidad de fotogramas de las imágenes y la intensidad de las fuentes de luz disponibles, ya que una velocidad de fotogramas más alta daría una visión más detallada y resuelta en el tiempo de la dinámica de la burbuja, pero requiere una iluminación más intensa debido a los tiempos de exposición más cortos. Para estudiar la liberación de partículas con más detalle, la velocidad de fotogramas para las imágenes de fluorescencia puede, en principio, aumentarse aumentando la intensidad de la luz láser. Sin embargo, la absorción de la luz láser de alta intensidad por las microburbujas marcadas fluorescentemente genera calor, incluso con tintes de alto rendimiento cuántico. Este calor puede interferir con los experimentos en juego y, en casos extremos, inducir la cavitación fototérmica52. Por lo tanto, en la práctica, hay un límite para la fluencia láser aplicada. Sin embargo, la iluminación láser intensa también se puede utilizar deliberadamente para inducir la liberación de partículas de liposomas53. La temperatura influye en la dinámica de las burbujas y en la respuesta del ultrasonido, dependiendo del tipo de burbuja54. Por lo tanto, si los métodos in vitro e intravital deben compararse objetivamente, los métodos in vitro discutidos en el protocolo deben realizarse a 37 °C. Otra limitación de los métodos in vitro discutidos en el documento actual es que las burbujas no están en un entorno de campo libre, ya que las microburbujas flotarán debajo de la membrana del soporte de la muestra. Además, existe un sesgo de selección al obtener imágenes de microburbujas individuales. Sin embargo, la realización de experimentos repetidos en burbujas individuales permite la investigación del efecto del tamaño y la eliminación del factor de confusión: la distribución del tamaño. Si la respuesta de la burbuja en función del tamaño se puede entender mientras que la concentración no es demasiado alta para evitar las interacciones burbuja-burbuja, se puede calcular la respuesta de cualquier población arbitraria de burbujas. Finalmente, tanto los métodos de microscopía de campo brillante como los de fluorescencia proporcionan información sobre microburbujas enrevesadas en una imagen bidimensional (2D). Si la pregunta de investigación requiere más de imágenes 2D, el comportamiento 3D de las burbujas se puede resolver combinando la configuración descrita en el protocolo con una configuración de vista lateral para imágenes multiplano55.
Un método alternativo para estudiar las microburbujas es la caracterización acústica56. Sin embargo, medir el eco de una sola microburbuja requiere localizar y aislar una sola microburbuja dentro del haz de ultrasonido56, lo que plantea un desafío típicamente abordado por el uso de un tubo estrecho o pinzas ópticas o acústicas57,58. Para dimensionar las burbujas acústicamente, las microburbujas pueden ser insonificadas en el régimen de dispersión geométrica a frecuencias muy superiores a su frecuencia de resonancia, lo que no induce oscilaciones volumétricas de microburbujas59. El uso de una "cámara acústica" es un método de este tipo para obtener imágenes de la dinámica radial de microburbujas individuales en respuesta al ultrasonido, en el que se utiliza una sonda de ultrasonido de alta frecuencia para determinar la respuesta radial de la burbuja a una onda impulsora de baja frecuencia60. La desventaja de este método es que solo se puede usar para determinar el cambio relativo del radio de la microburbuja; por lo tanto, se necesita otro método para determinar el radio de burbuja absoluto, por ejemplo, a través de imágenes ópticas61,62. La desventaja de los métodos en los que las microburbujas se exponen al ultrasonido a frecuencias superiores a su frecuencia de resonancia es que a frecuencias tan altas, la profundidad de penetración disminuye59, lo que limita la usabilidad para aplicaciones in vivo. También se pueden utilizar otras formas de microscopía para estudiar microburbujas como la microscopía electrónica de barrido, la microscopía de fuerza atómica y la microscopía electrónica de transmisión63. La resolución espacio-temporal alcanzable de estas técnicas alternativas de microscopía, sin embargo, es generalmente más limitada, y estas técnicas tienen la desventaja de que las imágenes se realizan antes o después de la exposición al ultrasonido mediante análisis fuera de línea y generalmente presentan un bajo rendimiento63. Otra alternativa es utilizar un método de dispersión de luz, que se puede utilizar para estudiar la dinámica radial de microburbujas individuales en tiempo real, pero tiene una baja relación señal/ruido en comparación con los métodos de dispersión acústica64.
La microscopía intravital en tiempo real durante la exposición al ultrasonido es un método poderoso para adquirir nuevos conocimientos sobre la vasculatura, el comportamiento de las microburbujas, las nanopartículas u otras moléculas (como el dextrano en este caso) durante la exposición al ultrasonido. Una limitación general al realizar microscopía intravital en tiempo real es que solo se toma una imagen de un área pequeña del tejido y la profundidad de penetración de la luz en el tejido es limitada. Si los vasos fotografiados contienen muy pocas microburbujas y/o nanopartículas dentro del campo de visión, se puede obtener poca o ninguna información sobre el comportamiento y la extravasación de las nanopartículas. Además, debido al campo de visión limitado, una alineación adecuada entre las rutas de luz y ultrasonido es crucial. Si la presión del ultrasonido es lo suficientemente alta como para inducir la destrucción de burbujas, también es importante elegir una frecuencia de repetición de pulsos que permita que las burbujas frescas se vuelvan a fusionar en el campo de visión entre los pulsos de ultrasonido. Además, como el ultrasonido se reflejará desde el vidrio de la cubierta en la cámara de la ventana y el objetivo, colocar el transductor en ángulo es importante para reducir los reflejos y evitar la formación de ondas estacionarias, que distorsionan el campo de presión calibrado. Otro problema práctico es que la configuración debe tener suficiente espacio para montar el transductor de ultrasonido y la guía de onda por encima o por debajo del objetivo en la configuración del microscopio. Los tumores en la cámara de la ventana dorsal tendrán un grosor limitado debido a la cámara de confinamiento y el deslizamiento de la cubierta; sin embargo, si es necesario, se podrían utilizar otros modelos. Algunos ejemplos son los tumores del pliegue cutáneo, por ejemplo, en la almohadilla de grasa mamaria65 o la imagen intravital abdominal de tumores en los diversos órganos66. Tales tumores pueden ser cultivados ortotópicamente en el microambiente apropiado, y como tal, presentan un caso clínicamente más relevante.
Los métodos descritos en este trabajo iluminan el potencial de las microburbujas marcadas fluorescentemente para estudiar los fundamentos de las aplicaciones de administración de fármacos utilizando burbujas y ultrasonido. Esta combinación de métodos de microscopía proporciona información valiosa sobre la respuesta de la microburbuja a la insonación por ultrasonido y su espacio de parámetros acústicos asociado y presenta una visión clara del comportamiento de la microburbuja y la carga útil en un rango relevante de escalas de tiempo y longitud.

El ultrasonido es la técnica de imagen médica más utilizada. Es no invasivo, rápido, seguro, rentable y portátil1,2,3. Sin embargo, la sangre es un dispersor de ultrasonido pobre, y el contraste de la piscina de sangre puede mejorarse mediante una inyección intravenosa de agentes de contraste de ultrasonido3. Este contraste mejorado del pool sanguíneo permite cuantificar la perfusión de órganos con fines diagnósticos, por ejemplo, en la detección de enfermedad coronaria4 y enfermedad hepática metastásica5. De hecho, la vasculatura tumoral demostró ser un factor pronóstico importante6. Un importante esfuerzo de investigación se dirige ahora hacia imágenes moleculares dirigidas asistidas por microburbujas y la adaptación de agentes de contraste para uso terapéutico.
Los agentes de contraste de ultrasonido disponibles comercialmente consisten típicamente en una suspensión de microburbujas recubiertas7,8 con diámetros que van desde 1 μm a 10 μm9. Dado que las microburbujas del agente de contraste por ultrasonido son ligeramente más pequeñas que los glóbulos rojos7, las microburbujas pueden llegar con seguridad incluso a los capilares más pequeños sin crear una oclusión3. Las microburbujas tienen un coeficiente de retrodispersión de ultrasonido dramáticamente mayor en comparación con el tejido10, debido a su núcleo de gas compresible11. Además, el eco de microburbujas es altamente no lineal, es decir, su espectro contiene armónicos y subarmónicos de la frecuencia de conducción. Además, la fuerza del eco depende en gran medida de la respuesta resonante de la burbuja12. Mientras que el tejido se dispersa solo linealmente, un pequeño número de microburbujas es suficiente para lograr una alta sensibilidad de detección en imágenes armónicas13,14. Esta generación de contraste no lineal puede incluso ser lo suficientemente fuerte como para rastrear burbujas individuales en el cuerpo15.
La cáscara del agente de contraste ecográfico estabiliza las burbujas contra la disolución y la coalescencia, aumentando así su tiempo de circulación en el grupo sanguíneo16. La cáscara puede consistir en lípidos, polímeros o proteínas desnaturalizadas3,8. Disminuye la tensión interfacial, limitando así el efecto de la disolución impulsada por presión de Laplace17 y crea una barrera resistiva contra la difusión de gas18. Para aumentar aún más la estabilidad, las microburbujas de contraste generalmente se llenan con un gas de alto peso molecular con baja solubilidad en sangre11. La carcasa de la microburbuja cambia drásticamente la respuesta de las microburbujas a la insonación ecográfica11. Las burbujas de gas no recubiertas tienen una frecuencia de resonancia característica que es inversamente proporcional a su tamaño y la adición de un recubrimiento lipídico aumenta la frecuencia de resonancia con respecto a la de un buble no recubierto debido a la rigidez intrínseca de la cáscara3. Además, la cáscara disipa la energía a través de la viscosidad dilatacional, que constituye la fuente dominante de amortiguación para las burbujas recubiertas3. La carcasa estabilizadora tiene la ventaja adicional de que se puede funcionalizar, por ejemplo, uniendo ligandos dirigidos a la superficie de las microburbujas. Esta focalización permite muchas aplicaciones para estas burbujas y, en particular, imágenes moleculares con ultrasonido14,19.
Los agentes de contraste de microburbujas son muy prometedores para aplicaciones de administración de medicamentos con ultrasonido. Las microburbujas que oscilan en el confinamiento de un vaso sanguíneo pueden causar microstreaming, así como tensiones locales normales y de cizallamiento en la pared capilar3. A altas presiones acústicas, las oscilaciones de gran amplitud pueden conducir al colapso de la microburbuja en un proceso violento denominado cavitación inercial, que, a su vez, puede conducir a la ruptura o invaginación del vaso sanguíneo20. Estos fenómenos violentos pueden inducir bioefectos como la sonopermeación21, potenciando la extravasación de fármacos terapéuticos en el intersticio a través de la pared endotelial, ya sea paracelular o transcelularmente. También puede mejorar la penetración de agentes terapéuticos a través de la matriz extracelular de tumores ricos en estroma21,22 y biofilms23,24, aunque este mecanismo aún es poco conocido26.
La administración de fármacos mediada por ecografía ha mostrado resultados prometedores tanto preclínicamente27,28 como en ensayos clínicos22. Además, cuando se usan con ultrasonido de frecuencia relativamente baja (~ 1 MHz), se ha informado que las microburbujas aumentan local y transitoriamente la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que los medicamentos ingresen al parénquima cerebral, tanto en estudios preclínicos como clínicos29,30,31,32,33,34.
En general, existen dos enfoques para la administración de fármacos mediados por ultrasonido: el material terapéutico puede ser coadministrado con las burbujas, o puede ser unido o cargado en la cáscara de la burbuja28,35,36. El segundo enfoque ha demostrado ser más eficiente en términos de administración de fármacos37. Las microburbujas pueden cargarse con fármacos o material genético encapsulado en nanopartículas (liposomas o nanoconstructos poliméricos) unidos a la cáscara o incorporados directamente en la carcasa de la microburbuja35,36. Las microburbujas cargadas de nanopartículas se pueden activar mediante ultrasonido (enfocado) para liberar localmente la carga útil de nanopartículas28,33,38,39,40. Si dicha microburbuja está en contacto directo con una célula, se ha demostrado in vitro que la carga útil puede incluso depositarse sobre la membrana citoplasmática celular en un proceso llamado sonoimpresión34,35.
El espacio de parámetros de ultrasonido para la insonación de microburbujas es extenso, y las condiciones biológicas in vivo agregan complejidad aún más. Por lo tanto, la combinación de ultrasonido enfocado y microburbujas cargadas de nanopartículas plantea un desafío en el campo de la terapéutica dirigida.
El objetivo de este trabajo es proporcionar protocolos que puedan utilizarse para obtener imágenes, en detalle, de la respuesta de las microburbujas en función de los parámetros de ultrasonido y estudiar los mecanismos que conducen a la ruptura de la cáscara y la posterior liberación del material de la carcasa marcado fluorescentemente. Este conjunto de protocolos es aplicable a microburbujas con conchas que contienen un tinte fluorescente. La Figura 1 muestra una representación esquemática de las microburbujas estabilizadas con nanopartículas y proteínas poliméricas desarrolladas en SINTEF (Trondheim, Noruega). Estas burbujas están llenas de gas perfluoropropano (C3F8) y las nanopartículas que estabilizan la cáscara contienen NR668, que es un derivado lipofílico del colorante fluorescente rojo del Nilo38,43. Las nanopartículas consisten en poli(2-etil-butil cianoacrilato) (PEBCA) y son PEGilados. La funcionalización con polietilenglicol (PEG) reduce la opsonización y fagocitosis por el sistema de fagocitos mononucleares, extendiendo así el tiempo de circulación14,44. Como resultado, la PEGilación aumenta la cantidad de nanopartículas que llegan al sitio objetivo, mejorando así la eficacia del tratamiento16. La Figura 2 ilustra cómo el uso de cuatro métodos de microscopía permite a los investigadores cubrir todas las escalas de tiempo y longitud relevantes. Cabe destacar que la resolución espacial alcanzable en microscopía óptica viene determinada por el límite de difracción, que depende de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica (NA) del objetivo y de la fuente de iluminación del objeto45. Para los sistemas en cuestión, el límite de resolución óptica suele ser de 200 nm. Además, la microscopía intravital se puede utilizar para obtener imágenes a nivel subcelular46. Para las microburbujas estabilizadas con nanopartículas y proteínas utilizadas en este trabajo, la escala de longitud mínima relevante para la microscopía intravital es el tamaño de los capilares pequeños (≥10 μm). Se describen experimentos de imágenes ópticas de alta velocidad in vitro (10 millones de fotogramas por segundo) e imágenes de fluorescencia de alta velocidad (500.000 fotogramas por segundo) para microburbujas individuales. Las imágenes de campo brillante de alta velocidad a escalas de tiempo de nanosegundos son adecuadas para estudiar la dinámica radial resuelta en el tiempo de las burbujas vibrantes. Por el contrario, la microscopía de fluorescencia de alta velocidad permite la visualización directa de la liberación de las nanopartículas marcadas fluorescentemente. Además, la estructura de la carcasa de la microburbuja se puede investigar utilizando microscopía confocal tridimensional (3D) de pila Z y microscopía electrónica de barrido (el protocolo para esta última no está incluido en el trabajo actual). La microscopía intravital consiste en utilizar la microscopía multifotónica para obtener imágenes de tumores que crecen en cámaras de ventana dorsal para proporcionar información en tiempo real sobre el flujo sanguíneo local y sobre el destino de las nanopartículas marcadas fluorescentemente in vivo47. La combinación de estos métodos de microscopía en última instancia proporciona una visión detallada del comportamiento de los agentes de microburbujas terapéuticos en respuesta al ultrasonido, tanto in vitro como in vivo.

<table><tbody><tr><td>100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026</td><td>Tabor Electronics</td><td></td><td>Arbitrary waveform generator (programmable)</td></tr><tr><td>2100 L</td><td>ENI</td><td></td><td>Amplifier, used in window chamber setup</td></tr><tr><td>2 MDa dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>33522 A</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup</td></tr><tr><td>A1R</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>ACE I</td><td>SCHOTT</td><td></td><td>Dimmable AC halogen light source</td></tr><tr><td>Atipemazol</td><td>Orion Pharma</td><td></td><td>Antidote to wake animal</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td></td><td>Enrofloxacin</td></tr><tr><td>BD Neoflon 24 G</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Company</td><td></td><td>Tail vein catheter</td></tr><tr><td>BNC model 575</td><td>Berkely Nucleonics Corporation</td><td></td><td>Pulse/delay generator</td></tr><tr><td>Branson 2510 Ultrasonic Cleaner</td><td>Branson</td><td></td><td>Ultrasonic bath</td></tr><tr><td>Channel slide</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLINIcell 25</td><td>Laboratoires Mabio International</td><td></td><td>Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, membrane thickness 175 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>Cohlibri</td><td>Lightline</td><td></td><td>Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)</td></tr><tr><td>DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td></td><td>Oscilloscope</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Actavis Group HF</td><td></td><td>Anaesthesia of mouse</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Supplement for cell culture medium</td></tr><tr><td>Fiber-optic hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td></td><td>Used for alignment</td></tr><tr><td>Flumanezil</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Antidote to wake animal</td></tr><tr><td>Heated animal holder</td><td>Custom design</td><td></td><td>A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37&amp;deg;C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber</td></tr><tr><td>Hyper Vision HPV-X2</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>High-speed camera</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health&amp;nbsp;and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin</td><td></td><td>open source image processing program</td></tr><tr><td>In vivo SliceScope</td><td>Scientifica</td><td></td><td>Multiphoton microscope</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOTON</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Filtered, phosphate-buffered saline solution</td></tr><tr><td>LUMPLFLN60XW</td><td>Olympus</td><td></td><td>Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)</td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Pulsed laser</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Programming environment</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Orion Pharma</td><td></td><td>Anesthesia of mouse</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Accord Healthcare Limited</td><td></td><td>Anesthesia of mouse</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck</td><td></td><td>Ultrapure water</td></tr><tr><td>MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Strobe light</td></tr><tr><td>Panametrics-NDT C305</td><td>Olympus</td><td></td><td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1&quot;, diameter 1&quot;)</td></tr><tr><td>Panametrics-NDT V304</td><td>Olympus</td><td></td><td>Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88&quot;, diameter 1.25&quot;)</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td></tr><tr><td>Perfluoropropane gas</td><td>F2 Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td><td>Gibco Thermo-Fisher</td><td></td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>Safe-Lock tube</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals</td></tr><tr><td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td><td>IKA laboratory technology</td><td></td><td>Dispersion tool</td></tr><tr><td>TDS 210</td><td>Tektronix</td><td></td><td>Oscilloscope, used in window chamber setup</td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Precision Acoustics Ltd</td><td></td><td>Used in window chamber setup</td></tr><tr><td>U-TLU</td><td>Olympus</td><td></td><td>Tube lens</td></tr><tr><td>VBA100-200</td><td>Vectawave</td><td></td><td>Amplifier</td></tr><tr><td>Window chambers</td><td>Custom made</td><td></td><td>Used in window chamber setup</td></tr><tr><td>XLUMPLFLN20 XW</td><td>Olympus</td><td></td><td>20x water dipping objective</td></tr><tr><td>XY(Z) translation stages</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-timescale microscopy methods for the characterization of fluorescently-labeled microbubbles for ultrasound-triggered drug release

Los agentes de contraste de microburbujas son muy prometedores para aplicaciones de administración de medicamentos con ultrasonido. La encapsulación de fármacos en nanopartículas reduce la toxicidad sistémica y aumenta el tiempo de circulación de los fármacos. En un enfoque novedoso para la administración de medicamentos asistida por microburbujas, las nanopartículas se incorporan en o sobre las conchas de microburbujas, lo que permite la liberación local y desencadenada de la carga útil de nanopartículas con ultrasonido. Una comprensión profunda de los mecanismos de liberación dentro del vasto espacio de parámetros de ultrasonido es crucial para una liberación eficiente y controlada. Este conjunto de protocolos presentados es aplicable a las microburbujas con una carcasa que contiene una etiqueta fluorescente. Aquí, la atención se centra en las microburbujas cargadas con nanopartículas poliméricas poliméricas de poli(2-etil-butil cianoacrilato), dopadas con un tinte rojo del Nilo modificado. Las partículas se fijan dentro de una cáscara de caseína desnaturalizada. Las microburbujas se producen por agitación vigorosa, formando una dispersión de gas perfluoropropano en la fase líquida que contiene caseína y nanopartículas, después de lo cual la cáscara de la microburbuja se autoensambla. Se necesita una variedad de técnicas de microscopía para caracterizar las microburbujas estabilizadas con nanopartículas en todas las escalas de tiempo relevantes del proceso de liberación de nanopartículas. La fluorescencia de las nanopartículas permite obtener imágenes confocales de microburbujas individuales, revelando la distribución de partículas dentro de la cáscara. Las imágenes in vitro de ultra alta velocidad que utilizan microscopía de campo brillante a 10 millones de fotogramas por segundo proporcionan información sobre la dinámica de las burbujas en respuesta a la insonación del ultrasonido. Finalmente, la liberación de nanopartículas de la cáscara de la burbuja se visualiza mejor por medio de microscopía de fluorescencia, realizada a 500.000 fotogramas por segundo. Para caracterizar la administración de fármacos in vivo, se estudia la liberación desencadenada de nanopartículas dentro de la vasculatura y su extravasación más allá de la capa endotelial mediante microscopía intravital en tumores implantados en cámaras de ventana del pliegue cutáneo dorsal, en una escala de tiempo de varios minutos. La combinación de estas técnicas de caracterización complementarias proporciona una visión única del comportamiento de las microburbujas y su liberación de carga útil en un rango de escalas de tiempo y longitud, tanto in vitro como in vivo.

Las microburbujas, producidas como se describe en el protocolo, se analizaron utilizando varios métodos de microscopía y en varias escalas de tiempo.
La fluorescencia de las nanopartículas en la microscopía confocal (Figura 6A) indica que la cáscara tiene una distribución de partículas no uniforme. Se pueden utilizar otros métodos de microscopía para la caracterización de burbujas. Por ejemplo, la Figura 6B muestra la estructura general de la microburbuja utilizando microscopía electrónica de barrido, como se presentó en trabajos anteriores34.
La dinámica radial y el comportamiento fenomenológico de las burbujas se pueden estudiar utilizando el método de microscopía de campo brillante in vitro descrito en el que se tomaron imágenes de microburbujas a 10 millones de fotogramas por segundo. El radio de las microburbujas individuales se extrajo a lo largo del tiempo utilizando un script escrito internamente. Un ejemplo de tal respuesta radial se muestra en la Figura 7.
En la figura 8A se muestra una secuencia de imágenes de la entrega exitosa típica de nanopartículas, como se describe en la sección 2.3.6. Se puede ver que las nanopartículas incrustadas en la cubierta de la microburbuja se iluminan debido a la fluorescencia cuando la luz láser llega a la burbuja. Impulsadas por la insonación por ultrasonido, las nanopartículas fluorescentes se desprenden del núcleo de gas de las microburbujas y se depositan en la membrana del soporte de la muestra. Finalmente, el láser se apaga y las nanopartículas fluorescentes ya no se excitan. La entrega infructuosa de la carga útil marcada fluorescentemente de las microburbujas generalmente se parece a la secuencia de imágenes que se muestra en la Figura 8B, donde las nanopartículas fluorescentes se iluminan en la cáscara de la microburbuja que permanece intacta durante la exposición al ultrasonido.
Se utilizó la microscopía multifotónica intravital en tiempo real durante el ultrasonido para investigar los efectos del ultrasonido y las microburbujas en el comportamiento de las nanopartículas en la sangre, la mejora de la permeabilidad de los vasos sanguíneos tumorales y la mejora de la administración de nanopartículas. Se puede caracterizar la extensión y la cinética de penetración en la matriz extracelular en función de la presión acústica, la frecuencia y la longitud del pulso. El efecto del tratamiento ecográfico puede variar con respecto al tamaño y la morfología de los vasos y el confinamiento resultante de la burbuja. Se puede determinar cómo el tratamiento de ultrasonido afecta el flujo sanguíneo y la dirección. Un experimento de ejemplo que muestra la extravasación de nanopartículas a lo largo del tiempo se muestra en la Figura 9 a un índice mecánico (IM) de 0,826. Los resultados de la microscopía multifotónica intravital dilucidan la extravasación espacial y temporal de las nanopartículas durante la exposición al ultrasonido, lo que es altamente beneficioso para la comprensión completa de los mecanismos subyacentes a la administración mediada por ultrasonido de nanopartículas y para optimizar dichas tecnologías26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de una microburbuja con una capa de nanopartículas poliméricas marcadas fluorescentemente en caseína desnaturalizada. Las microburbujas son típicamente entre 1 μm y 10 μm de diámetro. Las nanopartículas tienen un diámetro mayormente entre 100 nm y 200 nm38. Abreviatura: C3F8 = gas perfluoropropano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg"> Figura 2: Descripción general esquemática que muestra las escalas de tiempo y longitud relevantes para la microscopía de campo brillante, fluorescencia, confocal e intravital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg"> Figura 3: Representación esquemática de experimentos de microscopía de campo brillante. (A) Configuración experimental, (B) el diagrama de tiempo y (C) un marco grabado típico. Barra de escala en (C) = 10 μm. Abreviatura: fps = fotogramas por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg"> Figura 4: Representación esquemática de experimentos de microscopía de fluorescencia. (A) Configuración experimental, (B) el diagrama de tiempo y (C) un marco grabado típico. Barra de escala en (C) = 10 μm. Abreviatura: fps = fotogramas por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg"> Figura 5: Representación esquemática de experimentos de microscopía intravital. (A) Configuración experimental, (B) el diagrama de tiempo y (C) un marco grabado típico. Barra de escala en (C) = 50 μm. El verde corresponde al dextrano-FITC y el rojo a las nanopartículas. Abreviatura: GaAsP = fosfuro de arseniuro de galio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg"> Figura 6: Estructura 3D de una sola microburbuja estabilizada con nanopartículas y proteínas. (A) Uso de microscopía confocal para mostrar las nanopartículas, y (B) uso de un microscopio electrónico de barrido para mostrar la estructura 3D. (B) ha sido reproducido con permiso de34. Barra de escala en (A) = 5 μm; barra de escala en (B) = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg"> Figura 7: Oscilaciones esféricas típicas de una microburbuja estabilizada con nanopartículas y proteínas de 2,89 μm de radio insonificadas a una frecuencia de ultrasonido de 1 MHz y una amplitud de presión acústica de 142 kPa. (A-D) Imágenes de la grabación de alta velocidad y la curva de radio de burbuja correspondiente a lo largo del tiempo (abajo). Barras de escala = 5 μm, y la línea roja indica el radio inicial. El perfil de iluminación (unidades arbitrarias) se indica en amarillo. La ampliación es de 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg"> Figura 8: Secuencia de imágenes de microscopía de fluorescencia de alta velocidad. (A) Entrega exitosa de nanopartículas marcadas fluorescentemente de una microburbuja estabilizada con nanopartículas y proteínas insonificadas a una frecuencia de ultrasonido de 2 MHz y una amplitud de presión acústica de 600 kPa. (B) Entrega infructuosa de nanopartículas marcadas fluorescentemente de una microburbuja estabilizada con nanopartículas y proteínas insonificada a una frecuencia de ultrasonido de 2 MHz y una amplitud de presión acústica de 210 kPa. Barras de escala = 10 μm. La ampliación es de 120x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg"> Figura 9: Microscopía intravital después de la insonación de microburbujas estabilizadas con nanopartículas y proteínas a una frecuencia de ultrasonido de 1 MHz y una amplitud de presión acústica de 800 kPa. (A) Nanopartículas dentro del vaso, y (B) una secuencia de imágenes del área indicada por el cuadrado discontinuo blanco en (A) que representa la extravasación de dextrano (verde) y nanopartículas (rojo). Barras de escala = 50 μm. La ampliación es de 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Los protocolos presentados se pueden utilizar para caracterizar la respuesta de microburbujas marcadas con fluorescencia diseñadas para aplicaciones de administración de fármacos activadas por ultrasonido, incluidos sus mecanismos de activación y sus bioefectos. Este documento cubre una gama de técnicas de microscopía in vitro e in vivo realizadas para capturar la duración y las escalas de tiempo relevantes.

Métodos de microscopía a escala de tiempo múltiple para la caracterización de microburbujas marcadas con fluorescencia para la liberación de fármacos desencadenada por ultrasonido

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

Este protocolo se puede utilizar para caracterizar la respuesta de microburbujas marcadas fluorescentemente que están diseñadas para aplicaciones de administración de medicamentos activadas por ultrasonido, que incluyen los mecanismos de activación y los bioefectos. La clave está en la combinación de técnicas de imagen que nos permite desentrañar el problema multiescala de la administración de fármacos desencadenada por ultrasonido con burbujas, tanto a diferentes escalas espaciales como a diferentes escalas de tiempo. Para obtener imágenes de una sola burbuja mediante microscopía Brightfield, coloque una aguja de ventilación de calibre 19 y use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 19 para extraer una pequeña cantidad de la suspensión de microburbujas del vial de vidrio en un tubo pequeño para facilitar el pipeteo en el siguiente paso.Usando una pipeta, diluya la solución de microburbuja en solución salina tamponada con fosfato filtrado. Use una jeringa de 10 mililitros para inyectar la muestra en una salida del portamuestras hasta que el soporte esté lleno sin crear burbujas de aire, inyectando más de la muestra si es necesario. Cierre ambas válvulas del portamuestras y coloque el soporte de muestra perpendicular al eje óptico del microscopio.Antes del análisis de la muestra, establezca la frecuencia de conducción de ultrasonido y la presión acústica deseadas en el generador de forma de onda arbitraria y, comenzando con el campo de visión en una esquina del soporte de la muestra, use la etapa XYZ para mover el soporte para ubicar microburbujas individuales en el campo de visión del microscopio, luego conecte una fibra óptica conectada a un baño de agua a una luz estroboscópica e inicie la grabación. Repita la imagen tantas veces como desee por configuración de ultrasonido, moviendo el soporte de la muestra al menos dos milímetros a un campo de visión que contenga microburbujas no sincronizadas para cada análisis. Para imágenes microscópicas de fluorescencia de las microburbujas, después de diluir la solución de microburbujas en solución salina tamponada con fosfato como se ha demostrado, establezca la frecuencia de conducción de ultrasonido y la presión acústica deseadas en el generador de forma de onda arbitraria y establezca el retardo de disparo para el láser en el generador de retardo de pulso para la excitación de fluorescencia de las nanopartículas de las microburbujas, luego use la etapa XYZ para mover el soporte de muestra para localizar microburbujas individuales y ponerlas en el foco de el objetivo, luego activar la grabación.Repita la imagen como desee alterando la configuración del ultrasonido y moviendo el soporte de la muestra al nuevo campo de visión como se ha demostrado. Para la obtención de imágenes por microscopía intravital, primero coloque un soporte de animal calentado en la etapa de posicionamiento XY entre la guía de onda y el objetivo y agregue gel de acoplamiento a la guía de onda. Inserte un catéter de vena de la cola en la vena de la cola de un ratón anestésico portador de tumores y coloque el ratón equipado con una cámara de ventana en el soporte calefactado.Agregue una gota de agua a la cubierta. Para visualizar la vasculatura del tejido tumoral, inyecte por vía intravenosa 30 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de 2 megadalton dextrano marcados fluorescentemente en el catéter de la vena de la cola y use la etapa de traducción XY para mover al ratón hasta que se pueda localizar un campo de visión con vasos sanguíneos adecuados. Ajuste la velocidad de fotogramas, el campo de visión y la duración de la grabación de acuerdo con los parámetros del experimento y registre las imágenes de referencia de los recipientes.Cuando se hayan adquirido las imágenes de referencia, establezca la frecuencia de conducción del ultrasonido, la longitud del pulso y la amplitud de la presión acústica en el generador de forma de onda arbitraria e inyecte por vía intravenosa 50 microlitros de muestra de microburbuja en la vena de la cola. A continuación, imagine la vasculatura como se demuestra. El análisis de las microburbujas por microscopía de fluorescencia confocal revela una distribución de partículas no uniforme de la cáscara de la microburbuja.La estructura general de las microburbujas se puede visualizar aún más mediante microscopía electrónica de barrido. El análisis de la dinámica radial y el comportamiento fenomenológico de la microburbuja insonificada mediante microscopía brightfield permite la valoración del cambio relativo en el radio de la microburbuja a lo largo del tiempo. Aquí, se muestra una secuencia de imágenes de una entrega exitosa típica de nanopartículas marcadas fluorescentemente.Se puede observar que las nanopartículas incrustadas en la cubierta de la microburbuja emiten fluorescencia cuando la luz láser llega a la burbuja. Sin embargo, como se observó en esta entrega fallida, las nanopartículas fluorescentes se iluminan sobre la cáscara de la microburbuja, que permanece intacta durante la exposición al ultrasonido. Las imágenes intravitales de múltiples fotones se pueden utilizar para determinar la extravasación espacial y temporal de las nanopartículas durante la exposición al ultrasonido, lo que puede ser beneficioso para comprender y optimizar los mecanismos subyacentes a la entrega de nanopartículas mediadas por ultrasonido.Con la alineación perfecta de las vías ópticas y acústicas en todas las escalas de longitud y tiempo, se proporciona una visión completa de la administración de medicamentos desencadenada por ultrasonido. Las respuestas entregadas por nuestros experimentos multiescala ahora se traducirán a la práctica clínica. Los resultados proporcionarán información valiosa para una variedad de aplicaciones terapéuticas, incluida la terapia contra el cáncer.

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