11.18 : Chromatographie liquide haute performance: processus d'élution

En chromatographie liquide haute performance (HPLC), le processus d'élution est essentiel à la séparation des analytes et à la qualité des résultats chromatographiques. L'élution décrit la manière dont les composés se déplacent dans la colonne et se séparent en fonction de leurs interactions avec les phases mobiles et stationnaires. Ce processus détermine la résolution, la forme du pic et les temps de rétention dans le chromatogramme, qui sont essentiels pour identifier et quantifier les composants dans des mélanges complexes. La compréhension du processus d'élution aide à interpréter les données chromatographiques et à améliorer l'efficacité de la séparation.

La HPLC utilise des solvants de qualité HPLC très purs pour garantir une interférence minimale des impuretés. Les solvants de haute qualité sont essentiels car même des traces de contaminants peuvent interférer avec le processus d'élution, déformer les pics du chromatogramme et réduire la sensibilité lors de la détection des échantillons. De plus, les solvants peuvent contenir des gaz dissous tels que l'azote et l'oxygène, qui peuvent également interférer avec la détection des échantillons. Le dégazage est utilisé pour éliminer ces gaz, en utilisant soit une pompe à vide, soit une purge avec de l'hélium gazeux, afin de maintenir l'intégrité des processus de séparation et de détection.

Les solvants dégazés sont ensuite extraits du réservoir de phase mobile par une pompe haute pression, la pompe à piston étant le type le plus couramment utilisé. La pompe se compose d'un piston et de deux clapets anti-retour, qui aspirent le solvant à l'aide du mouvement de va-et-vient du piston. Cependant, l'inconvénient de la pompe à piston est qu'elle produit un flux de solvant pulsé. Par conséquent, les systèmes HPLC modernes sont dotés d'un amortisseur d'impulsions connecté à la pompe pour résoudre ce problème. D'autres pompes, telles que les pompes volumétriques à vis, sont disponibles mais peuvent avoir des limitations telles qu'une capacité de solvant moindre et une capacité de charge à faible pression, ce qui les rend moins pratiques pour les changements de solvant.

Il existe deux types de processus d'élution : l'élution isocratique et l'élution par gradient. L'élution isocratique utilise un seul solvant ou une phase mobile tout au long de la séparation, tandis que l'élution par gradient implique un changement de composition pendant le processus de séparation. Cette méthode améliore l'efficacité de la séparation, réduit le temps d'analyse et améliore la résolution, ce qui conduit à des pics plus nets dans le chromatogramme. L'élution par gradient offre une meilleure résolution et produit des pics plus distincts et séparés, ce qui facilite l'interprétation du chromatogramme pour les mélanges complexes par rapport à l'élution isocratique.

Avant que la phase mobile n'entre dans la colonne, l'échantillon est introduit à l'aide d'un injecteur à boucle avec une vanne à deux positions. La vanne permet de diriger la phase mobile vers la colonne. En raison de la pression élevée en HPLC, l'injection d'échantillon ne peut pas être effectuée comme dans la chromatographie en phase gazeuse (GC). Les boucles d'échantillonnage, avec des volumes fixes allant de 0,5 microlitre à 2 millilitres, peuvent être interchangeables.