Microinjection d'embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

Résumé

Cette vidéo montre comment morpholino ou ARNm peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule pour diminuer ou augmenter le niveau des produits de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur.

Résumé

Un des avantages du poisson zèbre étudier est la facilité et la rapidité de la manipulation des taux de protéines dans l'embryon. Morpholinos, qui sont des oligonucléotides antisens synthétiques avec la complémentarité d'ARN cibles, peuvent être ajoutés à l'embryon de réduire l'expression d'un produit de gène particulier. Inversement, l'ARNm traitées peuvent être ajoutés à l'embryon pour augmenter les niveaux d'un produit du gène. Le véhicule pour l'ajout de deux ARNm ou morpholino d'un embryon est la microinjection. La microinjection est efficace et rapide, permettant l'injection de centaines d'embryons par heure. Cette vidéo montre toutes les étapes impliquées dans la micro-injection. Brièvement, les œufs sont prélevés immédiatement après avoir été pondus et alignés contre une lame de microscope dans une boîte de Pétri. Ensuite, une aiguille à pointe fine chargé de matériel d'injection est relié à un microinjecteur et une source d'air, et les contrôles sont microinjecteur ajusté pour produire un volume d'injection souhaitable. Enfin, l'aiguille est plongé dans le jaune de l'embryon et le morpholino ou ARNm est expulsé.

Protocole

Partie 1: La production d'œufs et de la collecte

1. La nuit avant l'injection, mis en place le poisson dans l'élevage des réservoirs avec des intercalaires en place. Pour augmenter la production totale d'oeufs, le poisson peut être mis en place dans un rapport de deux femelles pour un mâle, si désiré.
2. Le lendemain matin, après l'éclairage de la salle s'allument, tirez les diviseurs de plusieurs chars et de permettre à environ 20 minutes de temps de l'accouplement non perturbées.
3. En utilisant une passoire, ramasser les oeufs des cages d'élevage et les rincer avec de l'eau d'œuf. Verser les oeufs dans une boîte de Pétri avec de l'eau d'œuf et enlever les œufs non fécondés et les débris avec une pipette de transfert. Les poissons peuvent être regroupés dans de plus grands réservoirs pour produire des tours supplémentaires d'oeufs destinés à l'injection. Ajuster le calendrier de collecte des œufs afin de permettre un nombre maximal d'œufs à produire sans les laisser passer le stade de simple cellule.
4. Placer une lame de microscope inversé dans le couvercle d'un plat de Pétri de 100 mm. Utiliser une pipette de transfert pour aligner les oeufs contre le côté de la lame formant une seule colonne. Enlever l'eau excédentaire d'œufs de la diapositive en appuyant sur une Kimwipe contre le côté opposé les oeufs. (Figure 1A)

Partie 2: Aiguilles de traction, le chargement et la préparation

1. Avec un extracteur micropipette, tirez un verre OD 1.0mm capillaire dans deux aiguilles et le ranger dans un plat de Pétri de 150 mm en posant sur des rampes Silly Putty. Les aiguilles peuvent être retirés à l'avance.
2. Backloading l'aiguille avec 3 pi de matériel d'injection à l'aide d'une pipette microloader. Agiter le bolus vers la pointe de l'aiguille jusqu'à ce qu'il n'y pas ou peu de bulles restantes.
3. Allumez la source de l'air et microinjecteur. Insérez l'aiguille dans la microinjecteur et assurer une bonne étanchéité dans le boîtier. Vérifier que le micromanipulateur est dans une position adéquate pour permettre un large éventail de mouvements et d'ajustement. Apportez la pointe de l'aiguille dans le plan de vue du microscope, haute de la scène, et se concentrer sur le plus mince région de la pointe. Utilisez une pince forte pour pincer l'aiguille à un point qui laisse l'aiguille suffisamment étroite pour percer le chorion et le jaune mais toujours capable de délivrer une taille uniforme perle. Une goutte d'huile minérale sur un micromètre peut être utilisé pour calculer le volume de chaque injection. Lorsqu'elle est injectée dans l'huile, une bille d'un diamètre de 0,1 mm contient 500 pL de matériel d'injection (figure 1B); volumes d'injection de 500 pl ou 1NL sont généralement utilisés. Appuyez sur la pédale et de surveiller la taille de la perle tout en réduisant l'aiguille et en ajustant la pression d'injection au besoin. Volumes d'injection Idéal remplira environ 10% du volume de l'œuf. La qualité de la pointe de l'aiguille est cruciale à la fois à la facilité d'injection et de la qualité et la cohérence des résultats.

Partie 3: Injection

1. Assurez-vous que les embryons n'ont pas développé passé le stade de quatre cellules. Idéalement, les embryons doivent être au stade unicellulaire.
2. Abaissez l'aiguille vers la colonne d'œufs, de la tenue du plat en place avec votre main opposée.
3. Pierce la surface du chorion et entrez le jaune d'un seul coup en douceur tout en regardant pour tout écrasement ou déchirure de la vésicule ombilicale. Injecter le matériau d'injection dans le jaune (figure 1C). Éviter d'injecter des bulles d'air ou en étirant le jaune que ce soit peut être mortel pour l'embryon. De travail sur toute la ligne, ajuster la pression au besoin pour maintenir une taille uniforme et de perles, à l'aide d'une pipette, enlever les œufs non fécondés qui donnent ou sont détruits au cours du processus d'injection.
4. Après avoir complété une colonne d'œufs, utilisez un jet d'eau d'œuf pour déplacer les oeufs injectés dans une boîte de Petri propre. Répéter au besoin. Gardez plusieurs embryons non-injecté comme un contrôle. A la fin de la première journée, retirez embryons morts et d'enregistrer le nombre d'embryons injectés. Remplacer l'eau d'œuf dans le plat périodiquement pour réduire le risque d'infection.

Partie 4: Les résultats représentatifs

Selon ce qui est injecté, les embryons peuvent survivre à un taux inférieur à celui de leurs frères et sœurs non-injecté. Heureusement, il est facile d'injecter un très grand nombre d'entre eux, donc c'est rarement un problème. Il est normal d'exposer le développement morphants légèrement retardée.

Pour illustrer les résultats de la micro-injection, nous avons utilisé ce protocole pour manipuler les niveaux de la protéine de Coeur de Verre (HEG). Heg est une protéine transmembranaire requis pour le développement normal de coeur. En son absence, les embryons se développent avec des coeurs de vastes flux géantes et des chambres ^1. Nous injecté deux morpholinos précédemment non décrite contre la HEG, heg_e3i3_egfr1 et heg_e4i4_egfr2, à une concentration de 500 uM. A deux jours après la fécondation, les contrôles non-injecté fratrie semblent normales, comme attendu (figure 2A et B). Embryons injectés avec heg_e3i3_egfr1 ont œdème cérébral (figure 2C). Bien que le cœur de la plupart de ces morphants ont modifié la morphologie, leurs chambres sont de taille normale (figure 2d). Les embryons injectésavec des défauts d'exposition heg_e4i4_egfr2 coeur variable. Certains semblent normales, tandis que d'autres ont de vastes afflux et les oreillettes modérément élargie (figure 2E et F). Le mutant HEG, comme indiqué précédemment ^1, a une étendue immense afflux élargie et de l'oreillette (figure 2G et H).

Nous avons également injecté des embryons de type sauvage avec 400 ARNm ng / uL transcrit à partir de pleine longueur HEG ADNc. Alors que les contrôles non-injecté développer normalement (figure 3A et B), les embryons injectés avec HEG ARNm présentent un spectre de phénotypes allant de l'apparence de type sauvage à la cyclopie sévère, le raccourcissement de l'axe du corps principal, la nécrose de la tête et le corps, et les défauts de ligne médiane (figure 3C et D).

Embryons Figure 1. Être injectés sont alignés contre une lame de microscope dans une boîte de Pétri (A). Le volume d'injection est déterminée en injectant dans l'huile minérale placée sur un micromètre. Un volume d'injection de 500 pL, qui est couramment utilisé, a un diamètre de 0,1 mm (B). Immédiatement après l'injection, le morpholino ou ARNm est visible comme une tache dans le jaune ponctuent (C).

Figure 2. A deux jours après la fécondation, les embryons n'ont pas de défauts non-injecté brut (A) ou d'un phénotype cardiaque (B). Les embryons injectés avec les morpholino heg_e3i3_egfr1 ont œdème cérébral (C, flèche), mais cavités cardiaques de taille normale (D). Certains embryons injectés avec les morpholino heg_e4i4_egfr2 ont de vastes flux élargie et les oreillettes (E, F). HEG mutants ont de vastes flux fortement élargie et les oreillettes (G, H). (A), (C), (E) et (G) sont 4x images DIC; (B), (D), (F) et (H) sont 20x images DIC. un atrium =, il tractus = entrées.

Figure 3. A 24 heures après fécondation, les embryons non-injecté ont un corps long et rectiligne et sans défauts nécrose ou médiane (A) et deux yeux clairement définis avec un tube neural entre eux (B). Certains embryons injectés avec l'ARNm HEG, en revanche, présentent un axe du corps raccourci, la nécrose, somites misshaped (C), et cyclopie (D). (A) et (C) sont 4x images DIC; (B) et (D) sont 20x images DIC.

Discussion

Un des points forts du système modèle de poisson zèbre est la facilité avec laquelle les produits des gènes spécifiques peuvent être ajoutés ou éliminés de l'embryon par microinjection. Pour ubiquiste surexpriment une protéine particulière, l'ARNm codant il est injecté dans le jaune d'œuf au stade 1-cellule. Au cours du développement ultérieur de l'embryon, l'ARN est distribué dans tout l'organisme et traduit. A l'inverse, pour éliminer une protéine particulière, morpholinos sont utilisés. Morpholinos oligonucléotides synthétiques sont conçus avec la complémentarité des ARN antisens pour particuliers. Comme ARNm, morpholinos sont injectés dans le jaune d'œuf au stade 1-cellule. A l'intérieur de l'embryon qu'ils lient leurs ARN cibles, ce qui empêche la traduction.

La principale modification qui doit être faite pour chaque morpholino ou ARNm est la concentration du produit injecté. Une concentration trop élevée de l'ARNm soit morpholino ou peut causer toxicité non spécifique, tandis que chaque morpholino doit être testé empiriquement pour déterminer sa concentration optimale, généralement les concentrations de morpholino entre 200 um et 500 um renverser l'activité des gènes de manière efficace sans causer de non-spécifique des défauts. La taille exacte de l'ouverture de l'aiguille n'est pas crucial. Dans une gamme de tailles d'aiguilles, la pression d'injection et le temps d'injection peut être ajusté pour produire un bolus du volume correct.

Morpholinos ont de nombreuses applications, y compris la dissection fonctionnelle des domaines au sein d'une protéine. Lorsqu'ils sont conçus pour cible spécifique jonctions exon-intron, morpholinos permettra d'éviter l'apparition de l'épissage là. Nous avons examiné les effets de deux morpholinos qui lient jonctions exon-intron du pré-ARNm de la HEG. Le heg_e3i3_egfr1 morpholino lie la jonction entre l'exon 3 et l'intron 3, la prévention de la machinerie d'épissage de l'exon 3 incorporant dans des transcriptions matures. Le heg_e4i4_egfr2 morpholino supprime pareillement l'exon 4. Les deux exons 3 et 4 codent domaines contenant des répétitions EGF-like. Certains embryons injectés avec heg_e4i4_egfr2 modérément phénocopie le mutant; expériences supplémentaires seront nécessaires pour comprendre le rôle de l'exon 4 Heg dans le développement du cœur. Étonnamment, les embryons injectés avec heg_e3i3_egfr1 ont oedème cérébral, une caractéristique ne voit pas dans les mutants HEG. Cela peut être dû à la capacité de se lier morpholinos transcriptions maternelle qui ne serait pas affectée dans des mutants zygotiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310