Enregistrements aspiration simple cellule à partir de cônes photorécepteurs de la souris

Résumé

Nous allons montrer comment enregistrer les réponses flash à partir de cônes de souris en utilisant une électrode de succion.

Résumé

Photorécepteurs Rod et cônes dans la rétine sont responsables de la détection de lumière. Dans l'obscurité, des nucléotides cycliques-dépendants (CNG) des canaux dans le segment externe sont ouvertes et permettent aux flux de cations régulièrement vers l'intérieur à travers la membrane, dépolariser la cellule. Exposition à la lumière déclenche la fermeture des canaux CNG, bloque le flux cation courant entrant, et donc les résultats de l'hyperpolarisation cellulaire. Basé sur la polarité des photorécepteurs, une méthode d'enregistrement d'aspiration a été développé en 1970 que, contrairement à la classique technique de patch-clamp, ne nécessite pas de pénétrer la membrane plasmique

Protocole

Faire électrodes

1. Faire les électrodes d'enregistrement à l'aide d'un tire-micropipette et polir les électrodes avec filament chauffant sous le microscope. Pour cône de la souris d'aspiration d'enregistrement unicellulaire, le diamètre intérieur de la pointe de l'électrode est d'environ um 6-7.
2. Préparer des électrodes de référence. Peser agar à 1% dans de l'eau distillée. Faire fondre la solution d'agar dans le bain d'eau chaude. Remplissez les pipettes en verre (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) avec de l'agar à 1% en utilisant une seringue. Solidifier la gélose à la température ambiante pendant 10 minutes.
3. Couper les pipettes en deux moitiés à l'aide d'un couteau de diamant.
4. Faire tremper les électrodes de référence en solution de référence pour au moins 24 heures à 4 ° C.

Mise en place de l'expérience

5. Sombre adapter une souris dans une cage noire nuit.
6. Préparer 100 ml solution de référence et d'une solution de perfusion L (voir ci-dessous) et filtrer la solution.
7. Dissoudre 0,1% de BSA et 10 mM de glucose dans 20 ml solution de référence.
8. Calibrer l'intensité de la lumière du stimulateur optique en utilisant photomètre.
9. Montez la chambre d'enregistrement sur la platine du microscope inversé.
10. Bubble la solution de perfusion avec 95% d'O ₂ / 5% CO _2, il incubation à 40 ° C bain d'eau pour augmenter la solubilité du CO _2. La solution coule de la bouteille à la chambre d'enregistrement en passant par une résistance en céramique, il le réchauffement à 36-38 ° C. Le chauffe-eau doit être située aussi près de la chambre d'enregistrement que possible, idéalement au stade du microscope.
11. Ajustez le régulateur de débit pour un débit de environ 1-1,5 ml / min.
12. Remplir l'électrode d'enregistrement avec une solution de référence. Insérer l'électrode dans un porte-électrode. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles dans l'électrode. Monter le support sur le headstage de l'amplificateur. Connectez le titulaire d'un dispositif d'aspiration, qui est construit par le raccordement de tuyaux partiellement remplis d'huile minérale à l'orifice latéral du porte-électrodes. L'autre extrémité du tuyau est relié à un petit réservoir d'huile minérale, pour laquelle la pression peut être appliquée par la bouche.
13. Connectez l'électrode de référence à l'autre pôle de l'headstage. Lier le couple thermique (TC) à l'électrode de référence. Assurez-vous que les extrémités des électrodes et TC sont rapprochés pour que la lecture de température est considéré comme proche de la cellule que possible.
14. Allumez l'éclairage infrarouge pour visualiser l'électrode. L'électrode est considérée par caméra infrarouge relié à un moniteur. Centre de l'image d'électrodes sur le champ visuel et de l'écran en utilisant un micro-manipulateur.
15. Ajustez la position de l'étroite pointe de l'électrode de référence (2-4 mm) à l'extrémité de l'électrode d'enregistrement.
16. Régler la tension DC pour le chauffage de telle sorte que la température de la solution est d'environ 36-38 ° C.
17. Exécuter un test d'étanchéité pour vérifier la résistance des électrodes d'enregistrement, normalement environ 900 kQ.

Isoler la rétine de souris

18. Sous la lumière rouge sombre, euthanasier la souris adaptés à l'obscurité avec le CO ₂ et de dislocation cervicale. Marquer les globes oculaires à l'aide de la pointe d'un chalumeau de métal chaud en cautérisant le point le plus dorsal de la sclérotique légèrement. Énucléer les globes oculaires à l'aide des ciseaux. Toutes les procédures subséquentes sont effectuées sous la lumière infrarouge.
19. Hemisect les globes oculaires sous microscope avec éclairage infrarouge et convertisseurs d'images.
20. Retirez la cornée et le cristallin. Retirer autant du vitré que possible.
21. Pour enregistrer M-cône de réponses, enlever la partie ventrale de l'œilleton ⁴ avec une lame de rasoir en juger par la marque de cautérisation.
22. Peler la rétine de la couche de l'épithélium pigmentaire.
23. Aplatir la rétine et le placer sur le fond de la boîte de Pétri remplie avec 1-2 ml solution de référence.
24. Trancher la rétine en petits morceaux minces à l'aide d'une lame de rasoir et incuber la préparation dans une boîte étanche à la lumière saturée en oxygène pur.

Enregistrements

25. Éteignez le chauffe temporairement. Mettre le flux de la perfusion à un tuyau de dérivation pour empêcher la chambre de séchage.
26. Égoutter la plupart de la solution dans la cuve à l'aide d'un morceau de tissus Kimwipe. Transférer la suspension rétine à la chambre d'enregistrement à l'aide d'une pipette en verre.
27. Attendez environ 2 minutes jusqu'à ce que les tranches de la rétine s'installer. Mettez la perfusion de retour sur. Allumez le chauffage.
28. Allumez l'éclairage infrarouge pour visualiser la préparation. Recherche d'un morceau de la rétine couché sur la chambre avec des segments externes des photorécepteurs qui sort (voir la figure par exemple). Dessine des segments intérieurs doucement dans l'électrode par aspiration. Dans cette configuration, plusieurs noyaux et les segments intérieurs devrait être établi dans l'électrode. Enregistrez le photoréponse d'un flash lumineux pour tester si un segment de cône intérieur est dans l'électrode et si la cellule est guérissenttes, à en juger par la cinétique de réaction et d'amplitude.
29. Abaissez le réservoir de minéraux pour exercer une légère pression négative à la pointe de l'électrode pour aider à maintenir le segment intérieur de l'électrode.
30. Enregistrement test-éclair à partir des réponses aux DIM l'intensité lumineuse une fois qu'une cellule est jugée satisfaisante. Test clignote sont fournis à partir d'un stimulateur calibré optique ^5. L'intensité du flash et la longueur d'onde sont contrôlés par un ensemble de filtres de densité neutre et étroite bande de filtres d'interférence, respectivement. Test de durée du flash (20 ms) est contrôlé par ordinateur axée sur les volets.

Solutions

1. Solution de perfusion Souris: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 _mM de MgCl2, 1,2 _mM de CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO _3, 3 mM Na succinate, 0,5 mM Na glutamate, 0,02 mM EDTA, et 10 mM de glucose.
2. Solution de l'électrode d'enregistrement de la souris: NaCl 140 mM, 3,6 mM de KCl, 2,4 _mM de MgCl2, 1,2 mM CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM d'EDTA.

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Discussion

L'enregistrement d'aspiration mono-cellulaire de cellules photoréceptrices a été développé il ya 3 décennies. Il nous permet d'enregistrer le changement trans-membranaire courant induit par une stimulation lumineuse sans pénétrer la membrane cellulaire. En raison de haute adhérence cellule-cellule, il est difficile d'isoler saine seule tige et le cône de la rétine de souris, comme la rétine des amphibiens et il est difficile de trouver des cônes individuels en raison de la faible pourcentage...

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