Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Résumé

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Résumé

Granulocytes neutrophiles sont le groupe le plus abondant de leucocytes dans le sang périphérique. Comme phagocytes professionnels, ils engloutissent les bactéries et les tuer quand leur niveau intracellulaire fusible antimicrobien granulés avec le phagosome. Nous avons constaté que les neutrophiles ont un moyen supplémentaire de tuer les microorganismes: lors de l'activation, ils libèrent des protéines de granules et de la chromatine qui forment ensemble les fibres extracellulaires qui lient les agents pathogènes. Ces nouvelles structures, ou des neutrophiles pièges extracellulaires (EVF), dégradent les facteurs de virulence et de tuer les bactéries ^{1, 2} champignons et des parasites ^3. L'épine dorsale de structure des EVF est de l'ADN, et ils sont rapidement dégradés en présence des DNases. Ainsi, les bactéries exprimant DNases sont plus virulents ^4. En utilisant la microscopie corrélative alliant MET, MEB, immunofluorescence et de vivre des techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu montrer que lors de la stimulation, les noyaux des neutrophiles perdent leur forme et de l'UE et l'hétérochromatine homogénéiser. Plus tard, l'enveloppe nucléaire et les membranes des granules se désintègrent en permettant le mélange des composants NET. Enfin, les filets sont libérés que les pauses membrane cellulaire. Ce programme de mort cellulaire (NETosis) est distinct de l'apoptose et nécrose et dépend de la génération d'espèces réactives de l'oxygène par la NADPH oxydase ^5.

Neutrophiles pièges extracellulaires sont abondants dans les sites d'inflammation aiguë. NET semble être une forme de la réponse immunitaire innée que les microorganismes se lier, de les empêcher de se répandre, et assurer une forte concentration locale d'agents antimicrobiens à dégrader les facteurs de virulence et de tuer les agents pathogènes permettant ainsi neutrophiles de remplir leur fonction antimicrobienne même au-delà de leur durée de vie. Il ya plus de preuves, cependant, que les filets sont également impliqués dans les maladies qui vont de syndromes auto-immuns à l'infertilité ^6.

Nous décrivons des méthodes pour isoler granulocytes neutrophiles du sang périphérique humain ⁷ et les inciter à former des développements. Aussi nous inclure des protocoles de visualiser les filets dans la microscopie optique et électronique.

Protocole

1. Isolement PMN du sang humain

Utilisez environ 24 ml de sang humain avec de l'EDTA ou héparine (10 U / ml) comme anticoagulant.

1. Ajouter 6 ml 1119 Histopaque à un tube Falcon de 15 ml et soigneusement ml de sang couche de 5 à 7 entières sur le dessus.
2. Centrifuger pendant 20 minutes à 800 xg sans freinage.
3. Aspirer et jeter jaunâtres et clairs couche supérieure et le transfert phase inférieure rougeâtre contenant des granulocytes dans des tubes Falcon frais.
4. Laver les cellules en remplissant des tubes Falcon avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g.
5. En attendant de préparer une solution de Percoll à 100% en mélangeant 18 ml de Percoll avec 2 ml de PBS 10x. Avec 1x PBS préparer 4 solutions ml de 85%, 80%, 75%, 70% et 65% de Percoll.
6. Préparer deux tubes Falcon avec un gradient de Percoll par superposition de 2 ml de chaque point de pourcentage au-dessus de l'autre dans l'ordre décroissant.
7. Après centrifugation éliminer le surnageant, mélanger et remettre granulés cellules sédimentées dans 4 ml de PBS.
8. Soigneusement couche 2 ml de la remise en suspension sur chacun des gradients.
9. Centrifuger pendant 20 minutes à 800 xg sans freinage.
10. Après centrifugation retirer la couche supérieure et la plupart des 65% de la couche avec des PBMC et de recueillir des blancs interphases restant jusqu'à 85% de la couche dans des tubes Falcon de nouvelles.
11. Laver les cellules en remplissant des tubes Falcon avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g.
12. Retirer le surnageant et remettre les cellules sédimentées (généralement> 95% sont PMN) dans 2ml de PBS.
13. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.

2. Activation PMN

1. Préparer une plaque de 24 puits de culture cellulaire en mettant une solution stérile de 13 mm de glissement rondes couvercle en verre (# 1,5) dans chaque puits
2. Graine 2 x 10 ⁵ cellules dans 500μl RPMI (contenant 2% de sérum albumine humaine) par puits et incuber pendant 1h de CO ₂ étuve à 37 ° C.
3. Pendant ce temps préparer une solution de 600 nM PMA dans RPMI et ajouter aux cellules 100 ul par puits. Incuber de 15 min à 4 h de CO ₂ étuve à 37 ° C.
4. Fixer les cellules de 4% (concentration finale) paraformaldéhyde dissous dans du PBS.

PMA sert de contrôle positif et est jusqu'à présent l'agent le plus puissant pour induire la formation de NET. Alternativement, d'autres stimuli ou de co-culture avec des agents pathogènes peut être utilisé pour l'induction NET.

Le statut respectif de la formation des NET peut être vérifiée tout au cours du temps se déroule, si d'autres échantillons sont préparés en parallèle. Si un colorant d'ADN non-pénétrants, comme Sytox vert (Invitrogen) est ajouté aux cellules non-fixes, seul l'ADN extracellulaire sera détectée. Depuis la formation de nouveaux filets est en quelque sorte altérée en présence d'Sytox, pour chaque point dans le temps un échantillon parallèle doit être utilisé.

3. NET de détection par immunomarquage

NET sont très fragiles, même après fixation et doivent être manipulés avec grand soin, sinon la majorité seront perdus lors de la préparation.

1. Retirez délicatement lamelles de verre avec des cellules de la plaque attachée culture de 24 puits en le soulevant au bord d'une aiguille courbe et la saisir avec une pince fine. Mettez la lamelle à l'envers sur une goutte de PBS. Cela peut être fait sur une feuille de Parafilm couvrant un stand tube à essai. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min.
2. Incuber lamelles de la même manière à une baisse de 0,5% de Triton X-100 pendant 1 min à température ambiante à perméabiliser les cellules. Laver 3 fois en PBS pendant 1 min.
3. Préparer une chambre humide avec du parafilm et un tissu humide. Posez le couvercle glisse à l'envers sur une goutte de tampon de blocage (5% âne sérum) et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
4. Diluer anticorps primaires, par exemple la lutte contre Histon ms et RB anti-élastase neutrophile, en tampon de blocage.
5. Transfert couvercle glisse dans la chambre humide directement à partir du tampon de blocage sur une goutte d'anticorps primaire et incuber pendant 1 h à 37 ° C.
6. Lavez 3 fois pendant 5 min avec du PBS.
7. Diluer anticorps secondaire, par exemple la lutte contre dk ms Cy2 et dk anti-rb Cy3, en tampon de blocage.
8. Transfert couvercle se glisse dans la chambre humide sur une goutte d'anticorps secondaire et incuber pendant 1 h à 37 ° C.
9. Lavez 3 fois pendant 5 min avec du PBS. Selon vos options de microscopie par fluorescence, l'ADN tache pendant 5 min, soit avec Hoechst 33342 (1 pg / ml), qui aura besoin d'excitation UV ou Draq5 pour l'excitation bien rouges et laver deux fois avec dist. de l'eau.
10. Régler une baisse de Mowiol 20 pi sur une lame de verre et de monter des lamelles avec des cellules à l'envers. Les cellules doivent être entre la lamelle et la lame. La baisse de Mowiol va former une couche mince d'épaisseur homogène lorsque la lamelle est placée sur la goutte. Normalement, il n'ya pas besoin d'appuyer sur l'échantillon. Si vous voulez utiliser des lentilles non-immersion, l'échantillon est prêt pour l'inspection.Pour l'analyse microscopique avec des lentilles à immersion, laissez sécher le spécimen pendant environ 1 heure jusqu'à ce que le Mowiol a solidifié au bord de l'échantillon.

4. NET Préparation pour microscopie électronique à balayage (MEB)

1. Message fixer les cellules sur les lamelles de verre de 24 puits plaque avec du glutaraldéhyde à 2,5%.
2. Retirer des lamelles de verre contenant des cellules de la plaque de culture à 24 puits et de mettre à l'envers sur une goutte d'eau. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min.
3. Transfert des lamelles de nouveau dans 24 puits, la plaque de culture cellulaire contenant 0,5% OsO4 et incuber pendant 30 min.
4. Retirer des lamelles de verre contenant des cellules de la plaque de culture à 24 puits et de mettre à l'envers sur une goutte d'eau. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min.
5. Transfert des lamelles de nouveau dans 24 puits, la plaque de culture cellulaire contenant 1% d'acide tannique et incuber pendant 30 min.
6. Répétez les étapes 04/02 au 04/04
7. Déshydrater à travers le schéma suivant (5min chacun):
   • 30% d'éthanol
   • 50% d'éthanol
   • 70% d'éthanol
   • 80% d'éthanol
   • Éthanol à 90%
   • 100% d'éthanol
   • 100% d'éthanol
   • 100% d'éthanol
8. Transfert couvercle glisse dans sécheuse point critique et des échantillons secs.
9. Manteau de la surface de spécimen avec 5nm platine / carbone calque à l'aide évaporateur à couche mince

5. Les résultats représentatifs:

La méthode d'isolement donne habituellement non stimulées neutrophiles viable avec une pureté supérieure à 95%. Lorsque fixé à différents moments après la stimulation, le protocole immunomarquage montre la séquence des changements morphologiques des cellules au cours NETosis aplatissement, une perte de lobules nucléaire, perte de granules et de l'intégrité noyau qui aboutit à un chevauchement croissant de l'énergie nucléaire (c'est à dire des histones) et granulaires (ie élastase neutrophile) coloration. Ce protocole peut servir de point de départ pour analyser les interactions spécifiques des pathogènes avec des neutrophiles. Cette interaction peut être disséqué de façon plus détaillée en utilisant le protocole de préparation pour la microscopie électronique à balayage.

NET fluorescence

Exemple de neutrophiles stimulés colorées pour NET (bleu = ADN, rouge = histones, vert = élastase neutrophile). Les images montrent, outre la localisation NET, la localisation nucléaire de l'ADN et les histones et le modèle granulaire pour l'élastase neutrophile.

SEM PMA de stimulation

Micrographie électronique à balayage montrant non neutrophiles stimulés et stimulés par PMA. Après stimulation, les neutrophiles s'aplatissent et produire NET.

NET SEM et Shigella

Une résolution plus élevée SEM image de bactéries Shigella piégés dans les filets.

Discussion

Le protocole doit permettre à l'isolement des non neutrophiles stimulés à la pureté considérable, l'induction de la formation nette et l'analyse des changements morphologiques au cours NETosis. Lors de la manipulation des échantillons avec soin, c'est à dire en évitant les difficiles conditions de lavage qui se traduira par la perte de la plupart des filets lâchement, le montant de la formation des NET dans des conditions de stimulation différentes (durée, relance) peuvent être comparés. À cet égard, les protocoles prévus peut servir comme point de départ pour établir des méthodes pour analyser les scénarios plus sophistiqués: l'interaction des neutrophiles / pathogène, la séquence de stimuli, interaction avec d'autres cellules immunitaires.