Flash de congélation et Cryosectioning E12.5 cerveau de souris

Résumé

Démonstration dans cette vidéo sont les techniques pour flash de congélation et de sectionnement des tissus cérébraux embryonnaires à partir de la souris. Conseils utiles pour l'utilisation du cryostat sont donnés, y compris les méthodes de dépannage qui peut être utilisé pendant la coupe pour s'assurer que les sections résultante tissus sont exempts de fissures et d'autres distorsions.

Résumé

Protocole

1. Fixer le tissu dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant le temps désiré.
2. Saccharose infuser tissus (cryoprotection)
   1. Faire solution de saccharose à 30% dans le PBS p / v en 2059 tube.
   2. Rincez le tissu 3x dans du PBS (~ 5 min avec bascule).
   3. Tissulaire lieu en solution de saccharose à 30%. Tissus ne va pas couler.
   4. Placez le tissu dans 4 ° C pendant la nuit, ou jusqu'à ce qu'il ait coulé.
3. Taille de l'étiquette appropriée cryomold d'information et d'orientation.
4. Remplissez cryomold avec OCT (éviter les bulles).
5. Transfert des tissus à bain d'PTOM et l'enrober avec octobre
6. Transfert des tissus aux PTOM cryomold.
7. Orienter les tissus sous microscope.
8. Verser l'azote liquide dans une boîte de Petri en plastique.
9. Rapidement et soigneusement bas le tissu dans cryomold dans l'azote. (Ne pas immerger le haut de la cryomold.)
10. Lorsque l'OCT est solide blanc, placez le tissu congelé en congélateur à -80 ° C pour le stockage.
11. Equilibrer les tissus à ~ 20 ° C pendant au moins 30 min. avant la coupe.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue-Tek Cryomold	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Sucrose solution			30% sucrose solution in PBS w/v
paraformaldehyde			4% paraformaldehyde in PBS