Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Method Article
Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. Vues des cultures vivantes montrent neurites et l'imagerie des niveaux de calcium en utilisant Fura-2.
Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation des cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. La procédure commence par l'enlèvement des cerveaux des animaux à 70-78 heures après la formation puparium. Les cerveaux isolés sont présentés après une brève incubation de la papaïne suivie de plusieurs lavages en milieu de croissance sans sérum. Le processus de dissociation mécanique de chaque cerveau dans une baisse de 5 ul des médias sur une lamelle est illustré. Les axones et des dendrites des neurones post-mitotiques sont fait une embardée hors près du soma au cours de dissociation, mais les neurones commencent à se régénérer les processus au sein de quelques heures de placage. Les images montrent des cultures vivantes moins 2 jours. Neurones continuer à élaborer des processus pendant la première semaine de la culture. Populations neuronales spécifiques peuvent être identifiées en culture en utilisant GAL4 lignes pour conduire l'expression tissu spécifique de marqueurs fluorescents tels que la GFP ou DP. Enregistrements de cellules entières ont démontré les neurones cultivés forme fonctionnelle, spontanément actifs synapses cholinergiques et GABAergiques. Un segment courte vidéo illustre la dynamique du calcium dans les neurones cultivés en utilisant Fura-2 comme un colorant indicateur de calcium pour contrôler transitoires calciques spontanées et la nicotine réponses de calcium évoquée dans un plat de neurones en culture. Ces cultures du cerveau pupe sont un système modèle utile dans lesquels des outils génétiques et pharmacologiques peuvent être utilisés pour identifier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui influencent la formation et la fonction des synapses centrales.
Les préparatifs avant le jour de la culture:
Le jour de la culture
I. Préparer la solution enzymatique (ES) en hotte à flux laminaire
II. Faire DDM2 des médias
Le jour de la culture: ajouter les suppléments suivants pour faire DDM2
A 10 ml de DMEM ajouter les suppléments, juste avant la culture:
Remarque: Assurez assez DDM2 pour toutes les cultures prévues (chaque cerveau plaqué sur une lamelle unique dans un plat individuel de 35 mm de Pétri, 1,5 ms de média / culture)
Etape III-VI peut être à une table de laboratoire non stériles fait et devrait être terminé en 45 minutes ou moins.
III. Les chrysalides Collection
Note: Nous utilisons généralement le cerveau à partir de pupes entre 55-78 heures après la formation puparium (CSA). Il est légèrement plus difficile à disséquer le cerveau de la jeune nymphe depuis le capsules céphaliques ont tendance à s'effondrer, tandis que le niveau global de la croissance des neurites est légèrement inférieure de la plus ancienne des pupes. Dans la souche Canton-S de type sauvage, ces étapes sont reconnus par les yeux qui sont pigmentées brun clair à légèrement rougeâtre, avec des pigments peu ailleurs.
IV. Décapitation au microscope disséquant
Retrait V. le cerveau de la tête sous loupe binoculaire
VI. Suppression des lobes optiques et un traitement enzymatique
A l'intérieur capuche à flux laminaire stérile - toutes les étapes où le tissu est exposé à l'air doit être fait dans une hotte à flux laminaire pour les étapes restantes.
VII. Lavage
VIII. Trituration et de placage sous loupe binoculaire
IX. Cellules nourricières
Neurones récoltés à partir de cerveaux de rongeurs embryonnaire / postnatale peut être cultivé en culture cellulaire primaire, où elles s'étendent neurites et la forme fonctionnelle des connexions synaptiques. Méthodes de préparation de ces cultures sont bien établies et d'études dans les cultures neuronales de rongeurs ont joué un rôle crucial dans l'identification des gènes et des facteurs environnementaux impliqués dans la régulation de la formation des synapses et de la fonction (Banker et Goslin, 1991). Alor...
Ce travail a été soutenu par le NIH aux subventions NS27501 DKOD. Un appui supplémentaire pour ce travail a été fourni par une subvention à l'UC Irvine en faveur de DKOD l'entremise du Programme Professeur HHMI.
Lamelles de revêtement: Mettre des lamelles autoclavés dans un plat de Pétri de 60 mm. Pipeter 5 ul de Con A mix / laminine au centre de chaque lamelle. Placer dans 37 C incubateur pendant 2 heures. Rincez lamelles 3x avec 100 ul d'eau autoclavée chacun. Utilisez l'aspirateur attaché à une pipette Pasteur stérile. Au cours du dernier rinçage, ramasser la lamelle avec une pince et sec des deux côtés. Transférer la lamelle d'un plat de Pétri de 35mm. Stocker à température ambiante pendant jusqu'à un mois.
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon