Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Résumé

Résumé

Protocole

Réaction de la transcriptase

Tourner bloc chauffant à 70-80 ° C et 42 ° C. Bains d'eau peut également être utilisé dans cette étape. Si l'aide de blocs de chauffage, mettre un peu d'eau afin que la chaleur est uniforme.

1. La réaction d'amorçage
   1. Prenez 3 pg d'ARN
   2. Réglez le volume à 13 ul avec de l'eau RNase
   3. Ajouter 2,5 pi de hasard hexamère amorces (2mg/mL)
2. Bien mélanger et incuber à 70-80 ° C pendant 8 minutes. Ensuite, placer sur la glace pendant 5 min.
3. Préparer un cocktail RT (14,5 l / Rxn):
   
   

   Composante	Volume
   5X tampon First Strand	6 pl
   0,1 M de DTT	3 pl
   25X aminoallyl-mélange de dNTP	1,2 ul
   SuperScript II RT (200U/μl)	2,3 ul
   Eau	2,0 ul

   
   * Pour les réactions n, préparer Mix Master 0.5 pour n aliquotes de cocktail pour vous assurer que vous ne manquerez pas.
   
   
4. Ajouter 14,5 ul de réactions refroidi.
5. Mélanger (ne pas vortexer) et incuber à 42 ° C pendant 3-4 heures
6. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C si nécessaire.

Hydrolyser l'ARN

1. Pour chaque échantillon, ajouter 3 l de NaOH 1 N et 0,6 ul de 0,5 M d'EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10 mM EDTA)
2. Mélanger et incuber à 65 ° C pendant 10 minutes.
3. Neutraliser en ajoutant 33,6 ul de HEPES 1M, pH = 7,0 (finale conc .= 500mm HEPES)
4. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C, si nécessaire.

Purification de réaction: Suppression des non constituée en société AA-dUTP et amines libres

Remarque: Ce protocole de purification est modifié par rapport au protocole de Qiagen QIAquick PCRpurification kit. Le lavage de phosphate et de tampons d'élution sont substitués aux tampons Qiagen fourni parce que les tampons Qiagen contiennent des amines libres en concurrence avec la réaction de couplage Cy colorant. Les colonnes de la trousse de mini-préparation peut également être utilisé.

1. Mélanger la réaction d'ADNc avec 300 pl (ou volume de réaction 5X = 336 ul) de tampon PB (Qiagen fourni) et le transfert à la colonne QIAquick.
2. Placer la colonne dans un tube collecteur de 2 ml (Qiagen fourni) et centrifuger à 13000 rpm ~ 1 minute. Tube de collection vide.
3. Pour laver, ajouter 750 pi de tampon phosphate de lavage (pas de Qiagen) à la colonne et centrifuger à 13000 rpm ~ 1 minute.
4. Vider le tube de collecte et de répéter le lavage 750 ul et l'étape de centrifugation.
5. Vider le tube de collecte et centrifuger la colonne 1 minute supplémentaire à vitesse maximale.
6. Transfert de colonne à une nouvelle tube de 1,5 ml et centrifuger ajouter prudemment 30 pi de tampon d'élution phosphate. (Voir la section préparation de la solution)
7. Incuber pendant 1 minute à température ambiante.
8. Eluer par centrifugation à 13000 rpm ~ 1 minute.
9. Eluer une seconde fois (avec un autre 30 ul de tampon d'élution phosphate) dans le même tube en répétant les étapes 6-8. Le volume d'élution finale doit être ~ 60 pl.
10. Le montant de l'ADNc peuvent être quantifiés à ce stade:
    ng d'ADNc = (facteur de dilution) (OD260) (37) (volume total élué de la colonne)
11. L'échantillon sec dans un Speed ​​Vac à 45 ° C.
12. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C si nécessaire.

Couplage aa-ADNc à Cy Ester Dye

1. Resuspendre aminoallyl-ADNc marqué avec 10 pl 50 mM de Na-bicarbonate de pH = 9,0 si nécessaire. (Ce tampon doit être frais tous les deux semaines)
2. Travailler dans un endroit sombre, ajouter la sonde à un tube de colorant Cy approprié. Pipet fois monter et descendre plusieurs resuspendre le colorant.
3. Incuber la réaction pendant 1 heure dans le noir à température ambiante. (Incubation peut aller jusqu'à deux heures)

Purification Réaction II: Prélèvement de colorant découplé

1. Pour la réaction, ajouter 35 ul de 100 mM pH 5,2 NaOAc. Mélanger soigneusement.
2. Ajouter 250 pi (ou volume de réaction 5X = 225 ul) Tampon PB (Qiagen fourni) pour chaque échantillon et mélanger par pipetage de haut en bas.
3. Placer une colonne spin QIAquick dans un tube collecteur de 2 ml (Qiagen fourni), appliquer l'échantillon à la colonne, et centrifuger à 13000 ~ 1 minute. Tube de collection vide.
4. Pour laver, ajouter 0,75 ml de tampon PE (Qiagen fourni) à la colonne et centrifuger à 13000 ~ 1 minute.
5. Répétez l'étape 4.
6. Tube de prélèvement vides et la colonne de centrifugation pour un supplément de 1 minute à vitesse maximale.
7. Colonne de la Place dans un endroit propre tube de 1,5 ml et centrifuger, prudemment, 30 pi de tampon EB (Qiagen fourni) pour le centre de la membrane de la colonne.
8. Incuber pendant 1 minute à température ambiante.
9. Eluer par centrifugation à 13000 rpm ~ 1 minute.
10. Eluer une seconde fois dans le même tube en répétantétapes 7-9. Le volume final doit être élué ~ 60 pl.

Analyse de la réaction de marquage

Le montant de l'ADNc et l'étiquette peuvent être quantifiés à ce stade:

• Mesure OD 260, 550 et 650 (blanc est l'eau.) Utilisez le programme biopuces Nanodrop.
• Calculer la pmol d'incorporation des colorants et l'ADN et nuc pmol / colorant rapport avec des équations ci-dessous:
  
  nucléotides pmol = [OD260 volume * (ul) * 37 ng / uL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Note: 1 OD260 = 37 ng / uL d'ADNc; 324,5 pg / pmol poids moléculaire moyen d'un dNTP)
pmol Cy3 = OD550 volume * (ul) / 0,15
pmol Cy5 = OD650 volume * (ul) / 0,25
nucléotides / ratio de teinture = pmol ADNc / pmol Cy colorants

Si vous utilisez Nanodrop, il donne déjà pmol / ul pour chaque colorant. Il vous suffit de multiplier ce nombre par le volume pour obtenir l'incorporation totale de teinture pmol.

Note:> 150-200 pmol d'incorporation de colorants par échantillon et un ratio de moins de 20 nucléotides / molécules de colorant est optimal pour les hybridations.

• Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à la noirceur.
  • Combinez des sondes à hybrider ensemble et sèche dans speedvac à 42 ° C.
  • Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'au moment de hyb.

Pré-hyb diapositives

1. Placer la lame vers le bas le visage plus RT 100 ml d'eau dans un support de diapositives rouges nettoyage pendant 3-5 minutes
2. Claquement sec de la diapositive en plaçant face visible sur une 100 ° C bloc chauffant pendant quelques secondes - montre pour la condensation à disparaître
3. UV réticuler la diapositive à 250 Mjoules (Entrez le réticulant 2500 à UV)
4. Hydratez diapositives par trempage dans l'eau pré-chauffée à 42 ° C. Spin 5 min à 700 rpm à température ambiante.
5. Incuber dans 50ml jarre de Coplin contenant préchauffé pré-hyb (5XSSC, 1% de BSA, 0,1% SDS) pour au moins 45 minutes @ 42 ° C, et l'incubation peut aller plus si nécessaire.
   
   50 ml de tampon de pré-hyb: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml de 5% de BSA, 0,5 ml SDS à 10%, 27 ml d'eau
   
   
6. Plongez dans les diapositives pré-chauffé de l'eau (42 ° C) et agiter quelques minutes pour enlever les pré-hyb tampon.
7. Rincer dans de l'isopropanol et de spin 5 min à 700 rpm, la température ambiante, à sécher.

Préparation des échantillons pour l'hybridation

1. Sonde Remettre en suspension dans l'eau (les volumes sont donnés ci-dessous)
   
   

   Pour volume total. = 30μl	Pour volume total. = 35μl	Pour volume total 40μl .=
   19,8 ul d'eau	23,55 ul d'eau	27,2 ul d'eau
   1,5 pl	1,5 pl	1,5 pl	10 mg / ml d'ADN de sperme de saumon (Invitrogen)
   1,2 ul	1,2 ul	1,2 ul	12,5 mg / ml d'ARNt
   4,5 ul	5,25 ul	6 pl	20XSSC (3X final)
   3 pl	3,5 ul	4 pl	SDS à 1%

   
   Note: L'ordre d'addition des réactifs sont importants. Ne pas préparer mélange maître.
   
   
2. Faire bouillir pendant 5 minutes, puis tourner 5 minutes à 14000 rpm. Refroidir pendant 2 min à température ambiante.

Hybridation

1. Ajouter 10-12 ul de 3X SSC pour les puits de la chambre d'hybridation sur chaque bord et au milieu.
2. Ajouter un bordereau de lifter propre à la zone appropriée de la lame et en douceur de charge dans la solution d'hybridation (30 -40 ul). Il devrait s'agir d'un échantillon supplémentaire sur chaque bord de la lamelle.
3. Placer la lame dans la chambre. Serrer les vis et les placer dans un bain d'eau à 65 ° C pendant la nuit. Ne pas placer la chambre directement sur le fond du bain-marie. Placer un bloc sur le dessus de la chambre supérieure pour tenir tout en place. Gardez le couvercle sur le bain d'eau pour protéger les échantillons sensibles à la lumière.

Lave Hyb

1. Préparer les tampons suivants:
   • 1X SSC, SDS à 0,05%
   • 0,06 X SSC
2. Après la chambre d'hybridation d'incubation desceller. Retirer la lame de la chambre, en prenant soin de ne pas déranger la lamelle.
3. Pour retirer des lamelles, des diapositives plonger dans un plat contenant 1X SSC chaude, 0,05% SDS lamelle tampon de lavage face au fond du plat. La lamelle va tomber en se déplaçant du côté de glisser sur le côté.
4. Après la lamelle est retirée, placer la lame dans un rack d'un bain chaud frais avec 1XSSCm SDS à 0,05%. Agiter pendant quelques minutes
5. Transfert diapositives plus porte à un bain de 0,06 X SSC.
6. Transfert diapositives à l'autre bae de 0,06 X SSC contenant un rack frais, buvard la lame sur une serviette en papier pour enlever autant de SDS-tampon contenant que possible avant de placer dans le bain frais.
7. Agiter diapositives pour un couple de minutes.
8. Spin immédiatement à la température ambiante pendant 5 min à 700 rpm, puis glisse êtes prêt à numériser. Conserver dans l'obscurité jusqu'à ce numérisées.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.