IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Résumé

La méthode IP-FCM est présenté, ce qui permet un sensible, robuste, l'évaluation biochimique de la maternelle interactions protéine-protéine, sans exiger le génie génétique ou échantillons de grande taille.

Résumé

Immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux (IP-FCM) est une méthode efficace pour détecter et quantifier les interactions entre protéines. Le principe de base vaut celle d'ELISA en sandwich, dans lequel l'analyte capturé primaire peut être détecté avec d'autres molécules physiquement associés au sein de complexes multiprotéiques. La procédure implique le couplage covalent de microbilles de latex de polystyrène avec immunoprécipiter anticorps monoclonaux (mAb) spécifique pour une protéine d'intérêt, l'incubation de ces perles avec des lysats cellulaires, sondant les complexes protéiques capturé avec fluorochrome conjugués des sondes, et l'analyse des billes associées à fluorescence par cytométrie en flux. IP-FCM est extrêmement sensible, permet l'analyse des protéines dans leur langue maternelle (non dénaturé) État, et est susceptible d'être soit l'analyse semi-quantitative ou quantitative. Comme autres avantages, IP-FCM ne nécessite pas de génie génétique ou de l'équipement spécialisé, sauf un cytomètre en flux, et il peut être facilement adapté pour applications à haut débit.

Protocole

** Ce protocole vidéo est basée sur une publication associée ^1: haute sensibilité de détection et d'analyse quantitative de la maternelle interactions protéine-protéine et de complexes multiprotéiques par cytométrie en flux. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE Science 2007 (389): PL2 5 Juin 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette publication .

Avant de partir, Préparer les solutions suivantes Stock aqueux:

MES tampon de couplage:	Conserver à 25 ° C
MES, pH 6,0	50 mM
EDTA	1 mM
Trempe / Blocage / Stockage (SBQ) Tampon:	Conserver à 4 ° C
BSA	1%
L'azide de sodium	0,02%
PBS, pH 7,4	1x
Tampon FCM:	Conserver à 4 ° C
Tris, pH 7,4	50 mM
NaCl	100 mM
L'azide de sodium	0,02%
FBS	5%
PBS, pH 7,4	1x

Préparer immédiatement avant l'utilisation:

EDAC-MES:	Dissoudre 50 mg / mL dans la poudre EDAC MES tampon de couplage
Digitonine solution (2% p / v):	Dissoudre la poudre digitonine en DH 2 O par chauffage à 95 ° C pendant 5min puis refroidir sur glace
Tampon de lyse:
Tris, pH 7,4	50 mM
NaCl	150 mm
Solution de digitonine	1%
Inhibiteurs de protéase	1x
Restez sur la glace

1. Couplage des mAb aux Perles

1. Déterminer la concentration de perles à partir du stock acheté par dilution dans du PBS et de compter avec un hématimètre. Commencez avec une dilution 1:10000 de perles pour le comptage.
2. Pipeter 18 x 10 ⁶ billes dans un microtube de 1,5 ml.
3. Laver les billes 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de tampon de couplage MES, centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage.
4. Resuspendre les perles dans 50 uL tampon de couplage MES.
5. Activer les groupes carboxyle sur les billes en ajoutant 20 uL d'fraîchement préparés EDAC-MES.
6. Mélanger doucement pendant 15 min à 25 ° C manuellement en aspiration et refoulement.
7. Laver les billes activées 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de PBS, la centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage.
8. Resuspendre les perles activé dans 50 ul de PBS.
9. Ajouter 50 uL de la propriété intellectuelle mAb (à 0.2 à 1.0 de concentration mg / ml) à la solution activée perle.
10. Mélanger pendant 3 à 4 heures à 25 ° C en plaçant le tube sur un vibrant shaker. Agiter suffisamment pour empêcher la sédimentation des perles sur le fond du tube.
11. Lavez-mAb couplée perles 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de PBS, la centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage.
12. Resuspendre les perles dans 100 uL de tampon QBS. Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C.
13. Suspension des billes ainsi, diluer 1:200-1:10,000 dans du PBS et compter avec un hématimètre. La concentration doit être mesurée pour chaque lot de préparation, de sorte que le nombre de billes utilisées dans chaque expérience IP ou pull-down peut être contrôlée avec précision.

2. Préparation lysat post-nucléaire et Ip

La méthode de lyse et les conditions de lyse optimale dépendra du type cellulaire et interactions protéine-protéine à l'étude. Un certain nombre de protocoles existent et peuvent être modifiés à votre application.

1. Lyse 20 x 10 ⁶ «petites» cellules, comme les lymphocytes, ou 5 x 10 ⁶ «grandes» cellules, telles que les macrophages ou les cellules tumorales, dans 100 uL de tampon de lyse frais dans un microtube de 1,5 mL pour 20min sur la glace. Échelle du volume lyse des besoins.
2. Pour retirer les noyaux et débris cellulaires insolubles, centrifuger le lysat à 20.000 g pendant 10 min à 4 ° C. Gardez le surnageant et jeter le culot.
3. Ajouter 0,5 x 10 ⁵ à 2,5 x 10 ⁵ mAb couplée perles au lysat clarifié, pipetage doucement pour mélanger. Le volume minimal que nous utilisons poureffectuer une seule adresse IP est de 5 ul.
4. Placer sur une roue de rotation vertical 4 heures pour une nuit dans une chambre froide. Réglez la vitesse suffisante pour empêcher les perles de s'installer. Il est acceptable pour le liquide de faible volume IP de rester dans le fond du tube pendant la rotation.

3. Sondage du talon-capturé des protéines avec des anticorps conjugués au fluorochrome

1. Laver les billes IP deux fois dans 0,2 à 1,0 ml de tampon glacé de la FCM, centrifugation à 20000 g à 4 ° C pendant 3 min après chaque lavage.
2. Resuspendre les billes en 100 FCM tampon et aliquot uL 20 uL dans chacune des cinq ou plus des microtubes de 1,5 ml ou puits d'une plaque de cheminée à fond.
3. Ajouter fluorochrome conjugués anticorps monoclonaux aux échantillons. Effectuez la FCM tache selon les instructions du vendeur ou en fonction de la concentration déterminée empiriquement. Comme point de départ, ajouter 0,2 à 1 microlitre de solution d'anticorps de stock (à 0,2 à 1,0 mg / mL) par tube ou un puits, et incuber pendant 40 min sur la glace.
4. Lavez sondé perles dans des tubes de 1,5 ml deux fois dans 1,0 ml de tampon FCM glacée, centrifugation à 20000 g à 4 ° C pendant 3 min après chaque lavage. Retirer délicatement le surnageant après chaque lavage, en prenant soin de ne pas déranger les perles. Pour une plaque de cheminée à fond, se laver deux fois avec 0,2 ml de tampon glacé de la FCM, centrifugation à 1000g pendant 5 min à 4 ° C après chaque lavage. Une pipette multicanaux est utile pour cette étape. Pour retirer le surnageant à partir de perles dans une plaque de cheminée à fond, «flick» la plaque une fois, puis, tout à l'envers, éponger les gouttes sur les bords du puits. Le volume résiduel dans chaque puits, contenant les billes, sera d'environ 20 pl.
5. Resuspendre les perles dans 200 uL de tampon de la FCM par échantillon. Transfert à l'étiquetage des tubes FACS. Les échantillons sont maintenant prêts pour la FCM.

4. Acquisition de la FCM

Les perles de LMC décrite dans ce protocole sont de 3 à 5 microns de diamètre, soit environ la moitié du diamètre d'un lymphocyte de souris au repos. Par conséquent, il peut être nécessaire d'augmenter manuellement le Forward Scatter (FSC) et le gain de l'ampli Side Scatter (SSC) de tension pour que la population d'événements billes de s'inscrire sur une échelle. Individuels perles IP devraient former une seule population étroitement groupés. Les réglages et les portes doivent être ajustées afin d'exclure doublets billes et des débris.

1. Avant de perles course ou normes perle, retirer le manchon de confinement qui entoure la goutte d'entrée d'échantillon sur certains cytomètres. Laisser le liquide de gaine goutte à goutte entre les échantillons, comme cela sera clair d'entrée et de prévenir les perles d'être reportés d'un échantillon à l'autre.
2. Utilisez des perles sans étiquette, un contrôle négatif de la fluorescence, et des particules d'étalonnage Rainbow (PCR), un contrôle positif de la fluorescence, d'ajuster les réglages de sorte que les deux extrêmes négatifs et positifs de fluorescence apparaissent simultanément sur le journal échelle axe des abscisses. Cela garantit que la fluorescence à partir des échantillons expérimentaux seront également sur l'échelle. Notez que les PCR sont plus petits que les grains atteints de LMC, alors FSC et SSC paramètres, ainsi que la position de grille, peut-être besoin d'être modifié temporairement pour cet échantillon.
3. Retour au sans étiquette-billes paramètres une fois l'étalonnage avec PCR est terminée. Si une seule sonde fluorescente par échantillon est utilisée, aucune compensation de fluorescence est nécessaire. En général, nous sondons complexes multiprotéiques avec un seul fluorochrome conjugués AcM par échantillon de la FCM, et nous examinons les partenaires d'interaction de plusieurs échantillons en parallèle par une coloration perle avec des Acm spécifiques pour les sous-unités différentes.
4. Acquérir et enregistrer la fluorescence des fichiers de données. L'analyse peut ensuite être effectuée en utilisant un logiciel de cytométrie en flux tels que CellQuest, FlowJo ou cflow.

5. Les résultats représentatifs

Figure 1. IP-FCM pour TCR/CD3 complexe multiprotéique. Lymphocytes T de la souche de souris Balb / c ont été lysées dans digitonine à 1%, et le lysat a été soumis à IP-FCM utilisant des anticorps anti-CD3ε perles. Les complexes capturé contenait des quantités importantes de TCR-β (région violet) et co-associé CD3-ε (vert), mais à proximité de niveaux de fond (défini par la sonde d'immunoglobulines non pertinents, rose trace) d'autres protéines telles que Thy1.2, CD45, ou H-2K (d) (marron, orange, et des traces bleues, respectivement). Voir similaires résultats publiés antérieurement ^1-6.

Discussion

Informations sur les interactions protéine-protéine est très pertinente pour l'analyse de nombreux processus cellulaires tels que la transduction du signal, la maturation lignée, progression du cycle cellulaire, l'apoptose et de cascades. IP-FCM offre un moyen rapide, quantitative, et sensible à examiner l'interaction de protéines et de définir les membres de complexes multiprotéiques dans leur conformation native. Perles peuvent être couplés et incubées avec des lysats de cellules en une seule journée et peut être sondé et analysé le lendemain. Un format de plaque de 96 puits permet un grand nombre d'échantillons à analyser à la fois pour fournir efficacement la collecte des données à des fins statistiques ou de dépistage. Utiliser fluorescents standards perle, le nombre de protéines capturées par chaque perle peut être estimé. Très peu d'matériel source est nécessaire pour la capture et la détection, afin d'échantillons limités et rares analytes peuvent encore être analysés pour de multiples interactions. Bien que IP-FCM n'a pas besoin du génie génétique, épitope-tagging, la dénaturation, ou in vitro de mélange de protéines dans un environnement non-physiologique, il peut être couplé avec ces techniques et d'autres, ce qui en fait un outil précieux et accessible avec applicabilité à de nombreux systèmes biologiques.

Dépannage:

Beaucoup IP FCM expériences génèrent des données utiles interaction protéine la première fois qu'ils sont tentées. Cependant, l'optimisation de la PI-FCM peut améliorer la conjugaison d'anticorps à des perles, la capture des protéines complexes et sonde fluorescente contraignant.

L'efficacité de la conjugaison d'anticorps IP peuvent être déterminées en sondant billes couplées directement avec un anticorps anti-immunoglobulines. Si ce rendement est faible, ce qui augmente la concentration d'anticorps lors de la réaction de couplage peut permettre anticorps plus IP à attacher à chaque bille. Cela peut augmenter la capacité de liaison des lots IP perle, entraînant la capture améliorée et la détection des analytes. Autres primaires-amine contenant des molécules (par exemple Tris, sérum albumine bovine) ne devraient pas être présents lors de la réaction de couplage, car ils peuvent rivaliser avec les mAb pour fixation de perles et entraîner des mAb faible couplage. Si la conjugaison de mAb à des billes s'avère problématique pour d'autres raisons, les perles peuvent plutôt être couplé à l'avidine / streptavidine, et des anticorps biotinylés peuvent ensuite être non covalente et utilisé pour immunprecipitation.

Malgré une bonne conjugaison d'anticorps, la détection initiale des billes associées à fluorescence peut être faible. Premièrement, la capture complexe lui-même peut être faible. Parce que IP-FCM dépend de la concentration des analytes, l'augmentation du nombre de cellules lysées par volume unité de lyse peut augmenter la capture et la détection analyte. De plus, la capture peut être améliorée en diminuant le nombre de billes IP incubées avec le lysat, qui distribue les complexes capturés dans moins de perles, et les résultats de la fluorescence moyenne a augmenté par bille lorsque sondé. Deuxièmement, il est possible que l'accès de l'anticorps sonde pour les complexes capturée est stériquement encombrés par l'anticorps immunoprécipiter. Dans ce cas, le problème peut être résolu en utilisant des anticorps différents pour capturer et / ou de la sonde.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)	Reagent	Interfacial Dynamics	2-5000	Store at 4°C.
Rainbow Calibration Particles	Reagent	Spherotech, Inc.	RCP-30-5A	Store at 4°C.
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)	Reagent	Sigma-Aldrich	M-5287
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)	Reagent	Sigma-Aldrich	22980 E-6383	Store at -20°C under desiccating conditions.
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	P-2714	Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves.
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney	Reagent	Fisher Scientific	08-408-230	For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining