Étudier l'influence gliales hétérogénéité cellulaire sur la croissance axonale aide d'une méthode coculture Nouveau

Résumé

Dans ce protocole, nous avons décrit une nouvelle méthode pour étudier l'influence de l'hétérogénéité des cellules gliales sur la croissance des axones avec un In vitro Système de co-culture. Corticaux de rat les cellules gliales ont été cultivées jusqu'à confluence et co-cultivées avec hautement purifiées du rat dorsale neurones ganglions de la racine. Différents une influence sur l'adhérence des cellules gliales et neurones croissance axonale a été comparé directement à la même culture. Cette méthode offre une nouvelle façon d'étudier directement l'influence des cellules gliales hétérogénéité sur l'adhérence et la croissance des neurones axone.

Résumé

Dans le système nerveux central de tous les mammifères, les axones sectionnés après une blessure sont incapables de se régénérer à leurs objectifs initiaux et la récupération fonctionnelle est très pauvre ^1. L'échec de la régénération des axones est le résultat combiné de plusieurs facteurs, notamment l'environnement des cellules gliales hostile, inhibition des molécules liées et une diminution de la myéline des neurones intrinsèques de régénération capacité ^2. Les astrocytes sont les cellules les plus prédominantes gliales dans le système nerveux central et de jouer un rôle important dans les fonctions axone sous la physiologie et la pathologie des conditions ^3. Contraste pour les oligodendrocytes homologues, les astrocytes sont une population cellulaire hétérogène composé par différentes sous-populations d'astrocytes avec des morphologies différentes et ⁴ l'expression des gènes. La signification fonctionnelle de cette hétérogénéité, comme leurs influences sur la croissance des axones, est largement inconnue.

Pour étudier les cellules gliales, en particulier la fonction de l'hétérogénéité des astrocytes dans le comportement des neurones, nous avons établi une nouvelle méthode de co-culture de haute purifiée dorsale neurones ganglions de la racine avec des cellules gliales obtenu à partir du cortex de rat. Par cette technique, nous avons pu comparer directement l'adhérence et la croissance des axones des neurones sur les sous-populations différentes astrocytes dans les mêmes conditions.

Dans ce rapport, nous donnons le protocole détaillé de cette méthode pour l'isolement et la culture des astrocytes, neurones ganglions de la racine dorsale isolement et de purification, et la co-culture de neurones avec GHM astrocytes. Cette méthode pourrait également être étendu aux autres régions du cerveau à l'étude cellulaire ou régionales interaction spécifique entre neurones et cellules gliales.

Protocole

1. Culture cellulaire Glia

Les cellules gliales peuvent être cultivées à partir de différentes régions du système nerveux central. L'ensemble du processus est montré dans la figure processus.

Jour 1 plaque de culture de revêtement et des lamelles

1. Dry rondes stérilisés lamelles de microscope en verre dans un autoclave.
2. Plaque les lamelles stérilisés dans la plaque de culture stérilisé de 24 puits.
3. Enduire les lamelles avec de la poly-lysine et incuber pendant 2 heures sous une température racine.
4. Manteau plaques de culture de 6 puits de la même manière qu'à l'étape 3.
5. Lavez les lamelles et la plaque de culture de 6 puits à deux reprises avec de l'eau distillée et sécher à l'air dans le capot de la culture.
6. Ajouter 200 pl de milieu DMEM (10% de FBS) dans chaque puits de la plaque de 24 puits et 2 ml dans chaque puits de la plaque à 6 puits et les mettre en étuve à 37 degrés avec 5% de CO ₂

Jour 2 du cortex isolation et de culture de cellules gliales

1. Stériliser la hotte à flux positifs de dissection.
2. Allumez la lumière UV pendant 20 min.
3. Pulvériser sur toutes les surfaces avec de l'éthanol 70% et attendre 15 minutes avant utilisation.
4. changement de tension: les ratons Anesthetize (P2-P6) par l'hypothermie, et décapiter à la base du magnum framen l'aide de ciseaux d'exploitation.
5. Ouvrez la boîte crânienne le long de la suture sagittale en utilisant un ciseau d'iris et de décoller le crâne.
6. Enlever le cerveau et les mettre en réfrigérée milieu L15, sous stéréomicroscope, nettoyer soigneusement la membrane-mère et pie avec des vaisseaux sanguins, d'isoler le cortex et laver plusieurs fois avec du milieu L15.
7. Couper le cortex en petits morceaux avec des ciseaux de microchirurgie.
8. Ajouter 0,125% de trypsine-EDTA préparé avec du milieu L15 en morceaux le cortex et incuber à 37 degrés pendant 15 min.
9. Transfert des blocs de tissus dans un milieu DMEM 20mL avec du FBS 20% en tube 50ml, ajouter à la solution mère de DNase 10ug/mL concentration finale, aspirer la solution des tissus haut et en bas pendant 20 heures avec le feu en verre poli Pasteure pipette, de recueillir la suspension seule cellule.
10. Laver les cellules en suspension une fois avec du milieu DMEM, rétablir la suspension des cellules dans du DMEM avec 10% de FBS, compter les cellules sous le microscope des cellules hémocytomètre une graine, à 5000-10000/cm ^2. Maintenir les cellules dans un 37 degrés incubateur à 5%, le changement de la moitié des 2 moyennes fois par semaine.

2. Ganglions de la racine dorsale Neurones isolement, de la Culture et de purification

Jour 1 Préparer le matériel de la culture

1. Enduire les lamelles stérilisés à la poly-lysine lamelles de lavage, deux fois avec distiller l'eau et l'air sec, les mettre dans des plaques 24 puits.
2. Ajouter 100 ul milieu Neurobasal avec 2% B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml), mettre la plaque en 37 CO degré 5% _2.

Jour 2 Isoler les GHM à partir d'embryons

1. Stérilisé la hotte à flux de la même manière que la culture de cellules gliales.
2. Euthanasier un rat enceintes (E15) par overdose avec du CO _2, de l'abdomen stérilisés par 70% d'éthanol, les embryons ont été isolées de l'utérus et de mettre en réfrigérée milieu L15.
3. Isoler avec des moelles épinières ganglions de la racine dorsale connecté sous stéréomicroscope et transfert à 35mm avec des plats refroidis milieu L15.
4. Recueillir suspension cellulaire unique et se laver une fois avec la FBN (milieu Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml)).

Jour 3 Purifier neurones DRG

1. 18h-24h après le semis neurone, ajouter une solution concentrée à 1 mM de stock FUDR à la culture de neurones à une concentration finale de 20 pM et un volume final de 200 pl.
2. 72h plus tard, de remplacer la moitié de la moyenne avec milieu Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50ng/mL) sans FUDR. Après cela, changer le milieu tous les autres jours.

3. Coculture avec des neurones DRG cellules gliales

1. Lorsque la culture de cellules gliales atteint la confluence (environ 20 jours après le semis), ils étaient prêts à co-culture avec les neurones.
2. 24 heures avant d'ajouter les neurones purifiés, gliales cellules moyennes ont été changées à moyen Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml).
3. Neurones purifiés ont été recueillies à partir des puits de culture, seule la suspension des cellules ont été obtenues par le passage mécanique grâce à la pipette Pasteure polies au feu.
4. Après avoir compté le nombre, les neurones ont été ensemencées à confluence 500/cm ² sur les cellules gliales dans le milieu de Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50ng/mL).
5. L'adhérence et la croissance neuritique des neurones sur les cellules gliales pourraient être enregistrées et analysées à différents moments par des logiciels d'analyse d'image et l'immunocytochimie utilisant des anticorps de type cellulaire spécifique.

4. Les résultats représentatifs

1. Culture de cellules gliales: Après l'ensemencement, les cellules gliales deviennent confluentes environ 20 jours. Sous microsc contraste de phaseOPE, il a été facilement identifiés que les différentes sous-populations de cellules gliales morphologiques différentes sous-structures formées modèle de croissance et les astrocytes GFAP positives représentaient plus de 90% comme indiqué par la technique immuocytochemisty (Figure 1, Figure 2).
2. DRG neurones de la culture: Dans notre méthode, après 72 heures de traitement FUDR, la pureté des neurones DRG atteindra aussi élevé que 99% dans les 6 jours, les neurones DRG ont montré leurs morphologies et unique avec une croissance de densité des neurites élevé (figure 3, figure 4).
3. Gliales et neurones coculture de cellules: les neurones et l'adhérence DRG neurites survenue facilement sur ​​les cellules gliales dans les 4 heures après l'ensemencement, l'observation minutieuse a montré que l'adhésion des neurones et la croissance des neurites ont été influencés par les sous-populations de cellules gliales qui forment spéciale soubassements modèle de croissance, ce qui pourrait être facilement identifiés sous le microscope à contraste de phase et par immunocytochimie (Figure 5, Figure 6).

Figure 1. Morphologie des cellules gliales confluentes. Corticales cellules gliales ont été plaqués sur la lamelle revêtement polylysine et cultivées pendant 20 jours, notez le modèle de croissance différents de cellules gliales, les cellules sur le côté gauche disposés de manière rayonnée.

Figure 2. Confluent cellules gliales étiquetés par la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP) anticorps. Notez la disposition rayonnée de la GFAP (en rouge) des cellules positives sur le côté droit.

Figure 3. Dorsale neurones ganglions de la racine a grandi in vitro, sans traitement FUDR. Les cellules contaminantes formé DRG fond neurones ».

Figure 4. Dorsale neurones ganglions de la racine a progressé après un traitement in vitro de FUDR. Les cellules de fond contaminant avait été complètement éliminé.

Figure 5. Dorsale neurones ganglions de la racine cultivée sur cellules gliales. Adhérence neurones et la croissance des neurites étaient inhibés sur les cellules rayonnée arrangé et limitée sur les cellules gliales côté droit.

Figure 6. Dorsale neurones ganglions de la racine de croissance sur les cellules gliales étiqueté par l'anticorps neurofilaments. Les neurites (vert) ont été inhibés sur le rayonnée disposées les cellules gliales côté gauche et limité sur le côté droit, toutes les cellules gliales ont été marqués par des anticorps GFAP (en rouge).

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Discussion

Ce protocole expérimental a été conçu pour atteindre deux objectifs d'étudier les cellules gliales, l'influence en particulier l'hétérogénéité des astrocytes sur l'adhésion des neurones et la croissance des neurites. Le premier objectif était de maintenir l'hétérogénéité des astrocytes autant que possible, dans cette expérience, la confluence des cellules gliales de la culture des astrocytes a été mélangé enrichi la culture primaire sans aucun traitement chimique et de la propag...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM(high glucose)	Invitrogen	10313-039
L15 medium	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
poly-lysine	Sigma-Aldrich	P4832	culture grade
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
B27 supplyment	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
neurofilament antibody	Abcam	ab24575