Microinjection d'embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

Résumé

Dans cette vidéo, Nijole Jasinskiene démontre la méthodologie employée pour générer transgéniques moustiques Aedes aegypti, vecteurs de la dengue. Les techniques pour la préparation correcte des aiguilles de microinjection, desséchants embryons, et effectuant la microinjection sont démontrés.

Résumé

Dans cette vidéo, Nijole Jasinskiene démontre la méthodologie employée pour générer transgéniques moustiques Aedes aegypti, vecteurs de la dengue. Les techniques pour la préparation correcte des aiguilles de microinjection, desséchants embryons, et effectuant la microinjection sont démontrés.

Protocole

Préparation à l'avance de la microinjection

1. Moustiques nourrissent de sang: pour l'injection du lundi au vendredi femelles se nourrissent sur le jeudi précédent.
2. Préparer des aiguilles de verre en utilisant le programme 3 ou 2 (voir matériaux).
3. Pose du tube pour le flacon de culture des embryons est la drosophile. Coton humide dans le fond, avec un disque de papier filtre humide qui la recouvre.
4. Préparer lamelle en plastique en collant double-face de la cassette à une extrémité. Bande de garniture à lamelle afin qu'elle se termine au bord de lamelle.
5. Préparer l'huile pour la dessiccation (voir Matériaux)
6. 150 bécher en plastique avec un coton humide dans le fond, recouvert d'un disque de papier filtre humide (80mm Whatman) pour garder les embryons après l'injection.

Mise en place de la pose forcée

1. Recueillir le sang de 60 à 10 femelles nourries avec l'utilisation d'un aspirateur et de les transférer dans le flacon de culture de drosophiles avec du coton humide et du papier filtre.
2. Mettez les moustiques de nouveau dans des conditions insectory dans l'obscurité, et de permettre à pondre des oeufs pour 1h et 15min.
3. Laissez adultes volent dans la cage et retirez le disque de papier filtre avec des embryons.
4. Pour aligner les œufs, le faire sous microscope à dissection. En utilisant des pinces fines n ° 5 ou un pinceau fin, choisissez gris à gris-noirâtre embryons et d'organiser en ligne sur le carré de papier Whatman 3MM imbibé d'eau. Tous les embryons doivent être dans la même orientation, comme l'injection doit être au pôle postérieur. L'extrémité antérieure de l'embryon est légèrement plus large que le postérieur. Sécher le papier filtre avec des embryons par pressage à sec du papier filtre pour le (les choses mouillées ne colle pas à la bande). Pour transférer les œufs, inverser la diapositive contenant l'adhésif double-face et appuyez doucement contre les oeufs. L'extrémité postérieure des œufs doivent être très proches du bord de l'adhésif double face.
5. Dessécher les embryons environ 1 min. à température ambiante. Ils commencent à fossette légèrement en séchant.
6. Couverture embryons desséchés avec de l'huile d'halocarbures pour éviter la dessiccation plus loin.

Microinjection des embryons

1. L'aspect le plus important de l'injection est la qualité de l'aiguille (voir matériaux).
2. Remplir une seringue avec la solution d'ADN à injecter en utilisant un microloader. Très peu d'une solution d'injection est nécessaire: 1 à 2 pl.
3. Connectez l'aiguille à la Transjector, qui contrôle le temps d'injection (Manu) et la pression (600), et la contre-pression (250). La microinjection est réalisée à l'aide d'un microscope avec une scène en mouvement (Leica) à un grossissement x 10 et micromanipulateur. Si nécessaire, une platine de microscope peut être soulevé par l'empilement de préparer des lames de microscope 4-5. Placer la lamelle transportant des embryons sur scène surélevée. Injecter embryons horizontalement pour empêcher la déchirure de l'endochorion; pénétration doit être au pôle postérieur. Pour l'injection, je garde l'aiguille immobile et déplacer le platine du microscope.
4. Injecter de 0.2 à 0.5 nl de solution, correspondant à environ 1-5% du volume d'embryon. Contrôle du volume d'injection en ajustant la pression d'injection et de temps. Le peu baissée, les embryons desséchés devraient retrouver leur injection turgescents après la comparution.
5. Choisissez embryons de la lamelle à l'aide de pinces fines ou un pinceau fin, et les placer dans un récipient en plastique avec du coton humide et humide papier filtre. Couverture bécher avec du papier absorbant. Gardez en place avec un élastique autour de la jante et le retour à des conditions insectarium pour 4 jours.

Post-injection

1. Quatre jours après, soigneusement le papier d'embryon lieu, l'embryon vers le bas, sur l'eau en grande boîte en plastique avec une petite quantité de nourriture. Les embryons éclosent sur une période très longue: ne jetez pas la culture au moins jusqu'à 4-5 semaines après l'injection.

Remarques

L'ADN pour l'injection

Solution d'ADN plasmidique pour l'injection a été isolé en utilisant Endofree kit plasmide. Construire et mélanger plasmide assistant ensemble à la concentration juste, précipités avec izopropanol. Le culot a été lavé avec de l'éthanol 70% avant la remise en suspension dans le tampon d'injection. Avant l'injection, l'ADN propre à l'aide Millex-GV colonne.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape