Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules

Résumé

Le poisson zèbre est apparu comme un puissant In vivo Plate-forme pour les écrans de la drogue basée sur le phénotype et l'analyse chimique génétique. Ici, nous démontrons une méthode simple et pratique pour criblage à grande échelle de petites molécules à partir d'embryons de poisson zèbre.

Résumé

Compte tenu de leur taille petit embryon, le développement rapide, la transparence, la fécondité, et de nombreuses similitudes moléculaires, morphologiques et physiologiques chez les mammifères, le poisson-zèbre est apparu comme un puissant

Protocole

1) Collection d'œufs de poisson zèbre

1. Sur l'après-midi précédant le jour de l'écran chimique, mis en place 10 à 20 bassins d'élevage de poisson zèbre. Remplissez chaque réservoir avec l'eau du système de l'aquaculture. En utilisant un filet de poisson, le transfert un mâle adulte et un à deux femelles adultes à l'intérieur de conteneurs dans chaque bac d'élevage. Séparez les poissons mâles et femelles de l'autre avec un diviseur. Étiqueter les cages et mettre un couvercle sur eux.
2. Le matin de l'écran, retirez les diviseurs de bassins d'élevage et de permettre le poisson-zèbre pour s'accoupler. Au cours de la prochaine 1 heure, permettent d'œufs fécondés de tomber à travers la grille au fond de chaque récipient intérieur.
3. Après 1 heure, le retour de poisson zèbre pour adultes de retour aux réservoirs de stockage permanent, retirez le récipient interne et ramasser les oeufs en filtrant l'eau dans chaque réservoir d'élevage à travers une passoire à thé en plastique.
4. Inverser la crépine sur une boîte de Pétri et rincer le filtre doucement à vider les oeufs dans la boîte de Petri en utilisant une bouteille de lavage contenant le milieu de l'E3.
5. Tous les œufs non fécondés, qui apparaissent opaque, doit être retiré à l'aide d'une pipette en plastique jetables. Chaque croix d'accouplement devrait produire environ 200 embryons.

2) rangeant embryons en plaques de 96 puits

1. Transfert d'environ 5 embryons dans le milieu de l'E3 dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en utilisant une pipette Pasteur en verre.
2. Une fois que les embryons sont disposés sur la plaque de 96 puits, enlever autant du milieu E3 que possible hors des puits en utilisant un 12-canaux (30 - 300 ul) pipette, en prenant soin de ne pas percer l'embryon. Utiliser la pipette à 12 canaux, de livrer 250 pi de milieu contenant de la kanamycine E3 0.5μg/ml à chacun des puits aussi rapidement que possible afin de ne pas permettre à des embryons à se tarir.
3. Mettre les plaques à 96 puits dans la pépinière 28,5 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré lorsque les composés à ajouter.

3) Transfert de banque de petites molécules

Alors que le transfert de composés peuvent être automatisées avec des méthodes de transfert de robotique, nous allons décrire la méthode de transfert manuel.

1. Bibliothèques de petites molécules sont généralement fournis dans un format de 96 puits, avec chaque composé stocké dans le DMSO comme un stock de 10 mm. Environ 60 minutes avant les embryons atteignent le stade où les composés sont à ajouter, décongeler un nombre souhaité de plaques de 96 puits contenant des aliquotes de petites molécules (plaque de source). Prenez note du numéro d'identification de série ou l'autre des plaques source. Pour réduire la condensation sur les plaques, la décongélation peut se produire dans une chambre de dessication contenant Drierite (WA HAMMOND Drierite CO, Xenia, OH).
2. Brièvement spin bas les plaques dans une centrifugeuse de table équipé d'un adaptateur plaque multi-puits.
3. Retirer le ruban adhésif en aluminium de la plaque source. Avec une pipette à 12 canaux, diluer les composés de la plaque source à la concentration de 0,5 mM (par exemple, si à partir de 250 nL aliquotes de stock 10mM, ajouter 4,75 ul de DMSO dans chaque puits).
4. Lorsque les embryons dans la plaque de 96 puits (plaque destinataire) atteindre le stade désiré, utiliser un 12-canaux (2-20 uL) pipette pour transférer 2.5μL de composés (0.5mm) à partir des plaques de source dans les plaques de récipient contenant le embryons.
5. Notez le numéro d'identification des plaques de source sur les plaques d'embryon receveur. Couvrir les plaques bénéficiaires désormais contenant les embryons et les composés avec des couvercles, mélanger délicatement les plaques en remuant doucement, et les placer dans un incubateur à 28,5 ° C.
6. Couvrir chaque plaque de source contenant de petites molécules inutilisées (0,5 mm) avec un ruban adhésif d'aluminium et placer dans un congélateur à -80 ° C pour stockage à long terme.

4) Le dépistage des effets de petites molécules par inspection visuelle des phénotypes

1. Avant de procéder à l'écran, de formuler un critère spécifique pour ce qui constituerait un "hit".
2. Au moment voulu dans le développement, enlever les plaques de 96 puits contenant le composé traités embryons de l'incubateur et d'examiner chaque puits sous un stéréomicroscope. Pour une meilleure visualisation des changements subtils, tels que des changements dans le modèle circulatoire, un microscope à contraste de phase inversée peut être utilisée. Fluorescent microscopie peut être utilisé pour examiner la perturbation de l'expression de la GFP ou protéines DsRed sous un promoteur tissu-spécifique.
3. Numériser rapidement les plaques à 96 puits pour un puits dans lequel au moins 3 des 5 embryons présentent le prescrit "hit" phénotype. Noter l'identité de la plaque et l'emplacement du puits de chaque hit potentiel.
4. Réitérer un hit potentiel en retester les effets du composé à des doses de plusieurs (1 uM, 5 uM, 10 um et 50 um). Pour chaque dose, 10 embryons ont été testés dans 0,5 ml de presse E3 dans un format de plaque de 48 puits. Le moment de l'addition composé pour le second test devrait être identique à celle du dépistage initial. Une touche est confirmée lorsque le phénotype provoqué est reproduit sur un nouvel essai sur l'compound
5. Identifier le composé frappé de la base de petites molécules chimiques dans la bibliothèque.

Discussion

Lors de la planification d'un écran chimiques à base de poisson zèbre, une attention particulière doit être portée à la robustesse du phénotype à l'étude et le taux de base du phénotype tel. Ceci est particulièrement important pour les écrans des suppresseurs chimique d'un phénotype induit. Par exemple, pour un phénotype causé par un choc thermique par induction d'un transgène, la condition qui provoque le phénotype reproductible doit être précisément tracé avant de lancer l'éc...

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