Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans

Résumé

Le ver nématode intensément étudié Caenorhabditis elegans Peut être transgénique conçue pour exprimer la β-amyloïde humaine peptide (Aß). Expression induite de Aß dans le C. elegans conduit à une rapide, une paralysie phénotype reproductible qui peut être utilisé pour surveiller les traitements qui modulent la toxicité Aß.

Résumé

L'accumulation du peptide β-amyloïde (Aß) est généralement considéré comme central pour l'induction de la maladie d'Alzheimer, mais le mécanisme pertinent (s) de toxicité sont encore mal connus. Aßi est également déposée par voie intramusculaire dans myosites à inclusions, une myopathie sévère humaine. Le elegans intensément étudié ver nématode Caenorhabditis transgénique peut être modifié pour exprimer Aßi humaine. Selon le tissu ou le calendrier d'expression Aßi, vers transgéniques peuvent avoir des phénotypes facilement mesurables qui servent comme une lecture de la toxicité Aß. Par exemple, des vers transgéniques à expression pan-neuronal Aßi avoir des défauts est l'apprentissage associatif (Dosanjh et al 2009.), Tandis que les vers transgéniques avec des muscles spécifiques à l'expression constitutive montrent une progressive, dépendant de l'âge phénotype paralysie (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Un particulièrement utile C. elegans modèle emploie une mutation thermosensible dans le système de surveillance à l'ingénieur d'expression d'ARNm musculaire inductible par la température d'un transgène Aßi, résultant en un phénotype de paralysie reproductibles lors de changement de vitesse de la température (Link et al. 2003). Les traitements qui Aßi contrer la toxicité de ce modèle [par exemple, l'expression d'un transgène de protection (Hassan et al. 2009) ou l'exposition à des extraits de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproductible modifier le taux de paralysie induite par monter les rapports de température de ces transgéniques des vers. Nous décrivons ici notre protocole pour mesurer le taux de paralysie dans ce transgéniques C. modèle elegans, avec une attention particulière aux variables expérimentales qui peuvent influencer cette mesure.

Protocole

1) Préparation de nématodes médias Croissance plaques pour le dosage de la paralysie.

Paralysie des dosages sont effectués sur la norme de croissance des médias nématode (NGM) plaques utilisées en routine pour C. elegans de propagation et de la génétique (Stiernagle, 2006).

1. Autoclave la solution contenant NaCl NGM, Agar et peptone dans un erlenmeyer et ajouter la quantité appropriée de stériles CaCl _2, l'uracile, cholestérol, 1M MgSO ₄ et 1M KPO _4. Aliquote de 10 ml de liquide dans chaque NGM 60 mm x 15 mm boîte de Pétri. Autoriser NGM à solidifier la nuit à température ambiante.
2. Si les tests pour les effets de composés / extraits, partie aliquote de l'extrait sur chaque assiette et l'utilisation d'un épandeur à répartir uniformément l'extrait sur la surface de la plaque. Laissez sécher une nuit d'extrait à température ambiante. Les volumes de plus de 1 mL, il faudra plus de temps à sécher.
3. Spot chaque assiette avec 250 pi de E. OP5O coli souche cultivée dans les médias LB nuit pour une densité optique de 0,4-0,6. Permettent aux bactéries de sécher une nuit à température ambiante.

Les variables pertinentes

L'âge des plaques a un effet significatif sur le dosage de la paralysie, car les anciennes plaques ont tendance à sécher. Utiliser des plaques versé dans la semaine du dosage paralysie. Pour des résultats optimaux, verser les plaques 3-4 jours avant l'initiation des populations de vers synchrone [voir (2) ci-dessous]. Pour toute expérience, utilisez uniquement des plaques versé à partir du même lot.

Modifier la taille de la pelouse (ie repéré vs propagation) et / ou le type de bactéries va également modifier le comportement des vers. Paralysie des dosages peuvent être effectués en utilisant d'autres E. coli comme source de nourriture (par exemple, la souche HT115 utilisées dans l'alimentation des expériences ARNi), mais cela peut changer la cinétique de la paralysie, ce qui nécessite des contrôles internes appropriés.

2) Préparation des populations de vers à l'âge synchrones

Strain CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aßi minigène + rol-6 du gène marqueur (su1006)] X est le plus couramment utilisé pour le dosage de Aß induite par la paralysie Cette souche et d'autres modèles transgéniques sont disponibles. aux chercheurs universitaires pour une somme modique à partir du Centre de Caenorhabditis Génétique (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Afin de maximiser la synchronie âge de la population test, il est préférable de commencer avec une génération synchronisée parentale. Une semaine avant l'ouverture de la paralysie de dosage de la population d'essai, utiliser un sélecteur de ver de platine pour le transfert de 20 à 30 adultes gravides sur plusieurs plaques de 10 cm NGM répandit avec OP50 pour un oeuf 2 heures était à 16 ° C (la température permissive pour CL4176 ). Retirez les adultes gravides et de permettre la progéniture de grandir pendant 7 jours, date à laquelle ils seront "deuxième journée" adultes gravides.
2. (Jour 1) La deuxième journée des adultes gravides sont utilisées pour préparer les populations critère de l'âge synchrone. Pour chaque condition expérimentale de l'objet est de générer des plaques en triple contenant de 50 à 75 ans-synchrone vers. Utilisation d'un sélecteur de ver de platine, le transfert 10-12 du 2 jours adultes gravides sur 60 mm (10 ml de volume) plaques NGM tacheté de OP50. Autoriser les vers à pondre des oeufs à 16 ° C pendant 2 heures, puis enlever les adultes et de permettre aux oeufs d'éclore et grandir à 16 ° C. À ce stade, il est préférable d'avoir quelqu'un qui ne sera pas marquer les plaques pour les coder, de sorte que le meilleur buteur sera aveugle aux conditions expérimentales.

Les variables pertinentes

Le stade de développement embryonnaire lorsque les œufs sont pondus (~ le stade de 26 cellules pour des vers de type sauvage dans des conditions optimales) est une fonction de l'âge adulte et la nutrition. Si les adultes gravides utilisé pour la préparation de la population de test sont plus âgés ou morts de faim, les oeufs ultérieurement seront portées, en réduisant la synchronie âge de la population et de la reproductibilité de la cinétique de la paralysie. Il est essentiel que les mono-axéniques (c'est à dire, seulement OP50 bactéries) les cultures sont utilisés (les contaminants microbiens peuvent gravement affecter ce test), et la reproductibilité est plus élevé si les plaques triple ont le même nombre de vers.

3) induction Transgene et Assay Paralysie

1. (Jour 3) plaques monter les rapports jusqu'à 25 ° C 48 heures après la fin de l'œuf synchrones laïque; les vers doivent être au troisième stade larvaire (L3). Les plaques doivent être disposées sans empiler dans un incubateur à 25 ° C pour permettre toutes les plaques d'atteindre 25 ° C dans le même temps.
2. (Jour 4) Commencez notation de la paralysie de vers (souche CL4176) à 18-20 heures après le début du changement de vitesse. À ce stade, tous les vers de la population devraient avoir atteint les larves de quatrième (L4) scène. Continuer score à deux heures par incréments jusqu'à ce que tous les vers sur chacune des plaques sont paralysés. Pour des raisons inconnues, la paralysie est même pas sur toute la longueur du corps: la tête de la région est la dernière partie du ver de cesser de bouger. Ainsi, wORMULAIRES qui ont récemment lancé une paralysie ne peut pas traduire à travers la plaque, mais peut se déplacer de leur tête, ouvrant ainsi les bactéries autour de leurs antérieure et en laissant un «halo» de bactéries effacés. Ces vers immanquablement devenir complètement paralysé, et donc des vers avec des halos sont classés comme paralysé. Certains vers n'aurez pas de halos, mais ne sera également pas montrer le mouvement spontané; ils sont testés par les aiguillonner avec le sélecteur de ver. Si un ver poussés ne peuvent pas subir une propagation complet du corps vague après insistance, il est aussi marqué que paralysé. Pour la notation efficace, il est plus facile de déplacer les vers paralysée à un secteur sans tache de la plaque de sorte qu'ils ne seront pas involontaire réécrite de la période de cotation suivant. (Cela permet aussi mal classé des vers afin de démontrer le mouvement, permettant une correction notation).
3. Pour générer une courbe de la paralysie, à chaque point de la fraction de vers sur chaque assiette qui n'ont pas été paralysée est convertie en un pourcentage, et la moyenne "paralysés" pourcentage est fonction du temps de l'initiation monter les rapports. (La justification de comploter dans ce sens est que la courbe obtenue est formellement analogue à une courbe de survie, et peuvent donc être analysés en utilisant la norme statistiques de survie non paramétriques.)

Les variables pertinentes

La montée des rapports de vers myo-3/Aβ transgéniques doit se produire avant qu'elles n'atteignent le stade de la mi L4 pour la paralysie d'être initié, comme le myo-3 promoteur est régulée par le développement, et a considérablement réduit son expression dans L4 en retard ou des vers adultes. De même, l'expression de ce transgène est bloqué si les vers deviennent affamés, il est donc essentiel que les vers sont bien nourris tout au long de l'expérience. Nous n'avons jamais observé un ver paralysés de récupérer dans n'importe quelles conditions, et après 12 à 16 h de monter les rapports, toutes CL4176 vers se paralyser, même si elles sont downshifted à 16 ° C. Dans la souche CL4176, régulation à la hausse suffisante de l'expression du transgène pour provoquer la paralysie peut survenir à des températures plus basses (ie, 20-25 ° C) même si le calendrier de paralysie sera modifié. Le taux de paralysie dépend de la souche spécifique transgéniques utilisées (nous avons construit des souches myo-3/Aβ avec les deux taux plus rapide et plus lent que CL4176), donc avec des souches de la fenêtre de notation alternatifs peuvent avoir besoin d'être ajustée.

Résultats Représentant 4)

Montre la figure 1 est un tracé d'une courbe de la paralysie pour CL4176, à la fois non traitées et exposées à 6,27 mM de caféine (concentration finale dans la plaque NGM). Ce traitement conduit à un retard statistiquement très significative de la paralysie d'environ 4 heures, que nous interprétons comme une indication de la suppression de la toxicité Aßi dans ce modèle. Montre la figure 2 est une expérience indépendante dosant les effets de cafestol, un autre composé qui se trouve dans le café. Cette parcelle est typique pour des traitements qui n'ont pas d'impact toxicité Aß. Notez que dans les deux expériences environ la moitié des populations traitées CL4176 sont paralysés à 24 heures, et la paralysie est complète en 28 h. Ces délais sont typiques de la paralysie de contrôle CL4176 populations. Des écarts significatifs à partir de ce moment sont révélateurs de modifier les conditions environnementales ou la suppression spontanée des copies du transgène. (CL4176 contient un tableau de chromosomes intégrée transgéniques avec plusieurs copies du transgène myo-3/Aβ. Bien que ce tableau transgénique est normalement très stable, toute propagation de la souche à des températures> 16 ° C sélectionnera pour les vers rares qui ont subi une suppression spontanée des transgènes, résultant en des variantes qui aura réduit l'expression Aßi et les résultats de paralysie plus lent.)

Figure 1. Courbe de paralysie pour la souche CL4176 les vers non traités ou exposés à la caféine 6,27 mM (Sigma). Les délais indiqués sont de l'initiation du changement de vitesse de la température. Les barres d'erreur = SEM

Figure 2. Les barres d'erreur courbe de la paralysie pour CL4176 vers exposés à 0,48 mM cafestol (Sigma). = SEM

Discussion

Le protocole que nous avons décrits peuvent être utilisés efficacement pour doser les effets des composés sur la toxicité Aß. Publié exemples incluent les effets des constituants d'extrait de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) et la réserpine (Arya et al. 2009). Les composés qui ont été protection contre la toxicité Aßi dans d'autres systèmes ont également été montré pour avoir un effet protecteur dans ce modèle (par exemple, la mémantine, nos résultats non publiés). Une justification importante pour l'établissement de ce modèle est que les outils bien développés génétiques et moléculaires disponibles en C. elegans peut être utilisée pour étudier les mécanismes de toxicité Aß. Ainsi, les mutations des effets spécifiques sur la toxicité Aßi peut être dosée (par exemple, l'effet de réduire insulin-like de signalisation par l'introduction d'un daf-2 avec perte de fonction de mutation, Florez-McClure et al. 2007), et ce modèle peut également être utilisé pour examiner les effets de la sur-expression des transgènes (Fonte et al. 2008). Nous avons récemment fait un large usage de ce modèle pour étudier les effets sur la toxicité de simples substitutions d'acides aminés dans les Aß (données non publiées).

Le modèle transgénique décrite ici l'effet des dosages d'expression Aßi aiguë sur la fonction des cellules musculaires. Au moment de la paralysie des cellules musculaires et de leurs sarcomères sont intacts; le phénotype paralysie n'est pas le résultat de la mort des cellules musculaires. Cependant, après la paralysie (~ 48 heures après la montée des rapports initiaux) il ya une rupture de l'intégrité musculaire et la mort éventuelle des vers. Nous n'avons pas enquêté sur cet effet en aval d'expression Aßi ou utilisé comme un marqueur de toxicité.

Le modèle expression inductible Aßi décrite ici n'est pas appropriée pour enquêter sur les traitements qui modulent β-amyloïde la formation en soi. Bien que les vers transgéniques avec la forme Aßi expression constitutive des dépôts amyloïdes facilement détectables (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), les vers transgéniques à expression inductible Aßi ont rarement des dépôts amyloïdes et le phénotype de paralysie apparaît indépendante des dépôts amyloïdes (Drake et coll. 2003). Nos résultats sont cohérents avec l'idée que la toxicité aiguë de l'expression des résultats induits Aßi de l'accumulation de Aß oligomériques solubles, pas de dépôts amyloïdes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs	Quantity/2L	Société / Catalogue #	Commentaires
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Peptone	5g	Sigma-Aldrich / P0556
ddH 2 O	2L
1M CaCl 2	2mL		147.02mg/mL dans le trou DDH 2 O
Uracile	2mL		2mg/mL dans le trou DDH 2 O
Cholestérol	2mL		5mg/mL dans de l'éthanol (ne pas autoclave)
1M MgSO 4	2mL		246.5mg/mL dans le trou DDH 2 O
1M KPO 4	50mL		98mg KH 2 PO 4. ML, 48 mg K2HPO4/mL dans le trou DDH 2 O, le pH
Erlenmeyer		VWR