Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Résumé

Transection du nerf optique est un modèle largement utilisé de blessure SNC adulte. Ce modèle est idéal pour effectuer un certain nombre de manipulations expérimentales qui ciblent la rétine au niveau mondial ou directement pour cible la population blessés neuronale des cellules ganglionnaires de la rétine.

Résumé

Cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont des neurones du SNC que les informations de sortie visuelle de la rétine au cerveau, via le nerf optique. Le nerf optique peut être consulté dans l'orbite de l'oeil et complètement sectionné (axotomisés), couper les axones de la population entière du CJR. Transection du nerf optique est un modèle reproductible de mort cellulaire par apoptose neuronale dans le SNC adulte ^1-4. Ce modèle est particulièrement intéressant car la chambre vitrée de l'œil agit comme une capsule pour la livraison de médicaments à la rétine, permettant des manipulations expérimentales par injections intra-oculaire. La diffusion de produits chimiques à travers le fluide vitré veille à ce qu'ils agissent sur l'ensemble de la population du CJR. Les vecteurs viraux, des plasmides ou court ARN interférents (siRNA) peut également être livré à la chambre vitrée afin d'infecter ou de transfecter des cellules rétiniennes ^5-12. Le tropisme élevé de virus adéno-associés (AAV) est bénéfique pour CGR cible, avec un taux d'infection de près de 90% des cellules à proximité du site ^{d'injection 6, 7, 13-15.} Par ailleurs, CGR peuvent être sélectivement transfectées par l'application de siRNA, des plasmides ou des vecteurs viraux pour l'extrémité coupée du nerf optique ou des vecteurs ^16-19 injectant dans leur cible du colliculus supérieur ^10. Cela permet aux chercheurs d'étudier les mécanismes de l'apoptose dans la population neuronale blessés sans effets confondants sur les neurones ou des cellules gliales d'autres spectateurs environs. RGC apoptose a une caractéristique du temps bien sûr où la mort cellulaire est retardée 3-4 postaxotomy jours, après quoi les cellules rapidement dégénérer. Ceci fournit une fenêtre pour des manipulations expérimentales dirigées contre les voies impliqués dans l'apoptose. Les manipulations qui ciblent directement les CGR de la souche du nerf optique sectionné sont effectuées au moment de la axotomie, immédiatement après la coupe le nerf. En revanche, lorsque les substances sont livrés par une voie intra-oculaire, ils peuvent être injectés avant la chirurgie ou dans les 3 premiers jours après la chirurgie, qui précède l'initiation de l'apoptose dans les CGR axotomisés. Dans le présent article, nous démontrons plusieurs méthodes pour des manipulations expérimentales après section du nerf optique.

Protocole

1. Technique chirurgicale

1. Les expériences doivent être réalisées en utilisant des techniques aseptiques et en suivant les protocoles d'utilisation d'animaux de votre institution spécifique. Instruments et matériel (solutions, des substances d'essai, traceurs, aiguilles, etc) qui entrent en contact avec les tissus vivants doivent être stériles pour prévenir l'infection et les impacts négatifs sur le bien-être animal et les impacts négatifs potentiels sur l'étude.

2. L'anesthésie

1. Les rats seront anesthésiés à l'aide d'un système de vaporisateur vétérinaires isoflurane. Utilisez oxygène médical à un taux de 0,8 L / min pour vaporiser le gaz isoflurane. Placez l'animal dans la boîte de l'anesthésie attachés et cadran en une concentration d'isoflurane de 4% jusqu'à ce que la respiration a ralenti et l'animal est calme.
2. Ensuite, passer le débit de gaz de l'attachement de masque à gaz pour le cadre stéréotaxique et de placer l'animal dans l'appareil de stéréotaxie. Tourner la concentration d'isoflurane à 2% et de surveiller l'anesthésie. Les plus gros animaux (> 300g) peut exiger une plus forte concentration d'isoflurane. L'anesthésie doit être surveillée pendant la chirurgie et la posologie ajustée en conséquence l'isoflurane. Profondeur et le taux de respiration doit être constamment évalué, et l'évaluation pincement de l'orteil (toutes les 5 min) pour l'absence de douleur profonde doit être réalisé.
3. Une fois l'intervention terminée, éteignez l'isoflurane et permettre à l'animal à l'oxygène souffle pendant plusieurs minutes avant leur évacuation de l'appareil de stéréotaxie. La température du corps doit être maintenu en couvrant l'animal avec une couverture chirurgicale et / ou en utilisant une couverture chauffante régulée pendant la chirurgie.

3. Préparation Seringue pour injections intraoculaires

1. D'abord, assemblez le système de seringue pour effectuer les injections intraoculaires. A 10 uL RN 1701 Gastight seringue Hamilton est utilisé pour l'injection. Retirez toute aiguille ou RN écrou présent sur la fin de la seringue.
2. Insérez l'embout PFA dans la tasse PEEK férule du raccord de compression. Ensuite, insérez le raccord complète dans l'extrémité de la seringue et lâchement visser l'écrou RN sur le dessus.
3. Insérez une extrémité du tube en PEEK 1 / 16 po dans le raccord de compression, grâce à l'ouverture de l'écrou de RN. Assurez-vous que le tube en PEEK est bien en place. Serrer l'écrou RN pour compresser la virole, d'étanchéité du tube en PEEK.
4. Effectuez l'étape 3.2 sur les deux extrémités de l'attelage RN en verre double. Fixez l'extrémité libre du tube en PEEK à une extrémité de l'attelage RN en verre double en serrant l'écrou RN.
5. Une micropipette de verre tiré formeront l'aiguille et le baril pour le système d'injection. Utiliser 1,5 mm OD épaisseur de verre à parois capillaires pour fabriquer les pipettes en verre, et d'insérer la pipette de verre dans l'extrémité libre du coupleur RN en verre double. Serrer l'écrou RN pour fixer la pipette en place.
6. La pointe fine de micropipettes de verre tiré est généralement trop petit pour réaliser des injections intraoculaires. Afin de créer une pointe de diamètre approprié, casser la pointe de la pipette en verre, sous guidage visuel, en utilisant un microscope chirurgical. La fin dépolie d'une lame de verre spécimen est bien adapté pour briser la pipette. Tenir la pipette à un angle et frotter le bout le long de la givrer le verre pour créer une pause. Idéalement, la pointe finale devrait être légèrement biseautés. Il peut prendre un peu de tentatives pour produire un bon pourboire, donc tirez pipettes multiples avant de l'utiliser.
7. Le système d'injection est hydraulique. Par conséquent, la seringue, linker tube en PEEK, double RN en verre coupleur et la micropipette de verre doit être rempli avec de l'huile minérale avant de l'utiliser. En utilisant le kit d'amorçage à partir seringue Hamilton Co. (PRMKIT), remplir la seringue d'amorçage avec de l'huile minérale. Utiliser une aiguille de gros diamètre pour permettre le passage facile de l'huile visqueuse. Remplacer l'aiguille avec le Hamilton 90030 aiguille qui s'adapte à l'intérieur du canon de l'seringue Hamilton 10 uL. Ensuite, placez une cloison en caoutchouc au cours de la Hamilton 90030 aiguille, afin d'assurer une étanchéité tout en injectant de l'huile minérale.
8. Insérez le Hamilton 90030 aiguille de la seringue d'amorçage dans le dos du baril de 10 uL seringue Hamilton du système d'injection. Appuyez sur la cloison étanche contre l'extrémité de la seringue pour créer un joint.
9. Enfoncez lentement le piston. Vous verrez le passage de l'huile minérale à travers les éléments en verre du système d'injection, et enfin le remplissage de la pipette en verre. Poussez la totalité du pétrole à travers le système d'injection afin d'éliminer les bulles d'air le long du tractus. Si la seringue de remplissage est à court d'huile minérale, lentement, retirer l'aiguille tout en permanence la distribution d'huile pour empêcher la formation de bulles d'air. Remplir la seringue d'amorçage et d'injecter de nouveau.
10. Lorsque le système entier est rempli d'huile minérale et sans bulle, insérez le piston d'origine du 10 uL seringue Hamilton. Appuyez sur le piston jusqu'à la fin de sa course afin d'enlever l'huile minérale supplémentaire du système. Essuyez la vitre micropipette propre et la fin de la seringue propre avec 70% d'éthanol.
11. Withdraw le piston de la seringue pour la marque de 2 uL sur le canon. La fin de la micropipette de verre va se remplir d'air offrant une zone tampon entre l'huile minérale et le fluide désiré d'être injecté. Le baril pipette peut désormais être rempli en plaçant l'extrémité de la micropipette dans la solution désirée et retirer le piston de la seringue Hamilton. Ne pas injecter plus de 4-5 uL de solution dans un oeil de rat adulte.

4. Procédure d'injection intraoculaire: cibler les Retina Globalement

1. Avec l'animal anesthésié et sécurisés dans le cadre stéréotaxique (comme décrit dans la section 2), l'utilisation des yeux Alcaine tombe à anesthésier localement la cornée. Ouvrez les paupières avec les doigts et déposer une goutte de la solution anesthésique à la surface de la cornée.
2. Injection nécessite deux personnes: une pour insérer la pipette en verre dans la chambre vitrée et maintenir la position pipette, et un autre pour appuyer sur le piston de la seringue, qui fournit la solution désirée.
3. Sous un microscope, l'adhérence au verre et chirurgicale micropipette en verre double coupleur RN avec vos doigts. Fais les paupières avec les doigts de votre main libre, formant un "V" en face du site d'injection. En exerçant une traction sur les paupières, l'œil sera élevée hors de l'orbite, d'exposer la face postérieure derrière le limbe. En créant un «V» avec les doigts en face du site d'injection, un berceau est formé pour assurer la stabilité de l'œil lors de l'injection.
4. Insérez délicatement la pointe de la micropipette de verre à travers la conjonctive, dans une zone dépourvue de vaisseaux sanguins, et à travers la sclère, à un angle vers le bas. Vous devriez sentir un petit "pop" quand la pipette pénètre la sclérotique. Insertion de la pipette à un angle légèrement vers le bas réduit la chance de frapper la lentille lors de l'insertion de l'aiguille.
5. La personne tenant la seringue doit désormais injecter le 4 uL de solution en appuyant sur le piston jusqu'à la marque de 2 uL sur la seringue. L'injection devrait prendre environ une à deux secondes au total. L'injection à un rythme très lent> 3 secondes réduit la propagation initiale de la solution à travers la chambre vitrée. Vous serez en mesure de voir la solution de rinçage injecté par la chambre vitrée sous le microscope, vérifiant ainsi le succès de la procédure.
6. Tenez la micropipette constante pendant environ 5 secondes, puis retirer, dans la même direction que l'aiguille a été insérée. La conjonctive se rabat sur la petite ouverture, en aidant à sceller les perforations scléral.
7. Couvrez la surface de la cornée avec un onguent oculaire ophtalmique (Tears Naturale PM) afin de prévenir le dessèchement cornéen lors de la récupération et le retour de l'animal dans une cage de récupération.
8. Post-chirurgicales analgésiques doivent être administrés selon les directives de vos autorités soins aux animaux, et les animaux doivent être surveillés avec attention après la chirurgie.

5. Cibler sélectivement les cellules ganglionnaires de la rétine de la souche Optic Nerve

1. Application des traceurs, des médicaments, des plasmides, des siRNA ou des vecteurs viraux pour la souche du nerf optique, après axotomie, cible directement les cellules ganglionnaires de la rétine par le transport rétrograde. Ceci est accompli en premier exécutant une transection du nerf optique selon le «protocole du nerf optique Transection» ^22.
2. Il existe deux méthodes principales pour accomplir cette procédure: en utilisant Gelfoam, ou l'injection directe dans le nerf optique.
3. La méthode est similaire à Gelfoam rétrogrades traçage, cependant lors de la livraison de traitements expérimentaux au nerf optique, il est souhaitable de pré-étiqueter les cellules ganglionnaires de la rétine par l'injection de traceurs rétrogrades dans le colliculus supérieur 1 semaine avant axotomie. Ceci est important pour la cellule de traçage parce que, dans certains cas traceurs neuronaux peuvent interférer avec le transport rétrograde de substances expérimentales ou vice-versa.
4. Immédiatement après le nerf optique est coupé, un petit morceau de Gelfoam trempé dans la solution expérimentale est placé sur le moignon du nerf optique sectionné. Le contenu orbitaire sont ensuite retournés à leur emplacement précédent. Lorsque l'œil est retourné à une position neutre, il est nécessaire d'utiliser une pince pour pousser le morceau de Gelfoam bas dans l'orbite, en s'assurant qu'il reste sur le bout du nerf optique.
5. La technique d'injection est plus efficace pour la livraison de substances qui doivent accéder au cytoplasme de l'axone pour être transportés par voie rétrograde flux axoplasmique. Cela inclut des siRNA et des plasmides, et dans certains cas des vecteurs viraux. Une seringue de 50 à 10 uL Hamilton est utilisée pour injecter la solution souhaitée dans le nerf sectionné optique.
6. Grip au bord du nerf optique avec de fines pinces à bout Dumont. Insérez l'extrémité de l'aiguille dans le nerf optique, parallèlement avec le nerf, jusqu'à ce que le biseau n'est plus visible. L'aiguille insérée sera enfermé de tous côtés par le nerf. Une aiguille à biseau court est souhaitable.
7. Une fois que le nEedle est inséré dans le nerf, presser doucement les côtés du nerf avec la pince à pointe fine et d'injecter un quart de la solution tout en tournant la seringue un quart de tour dans le sens horaire ou anti-horaire.
8. Continuer à répéter l'étape 5.7 jusqu'à ce que vous avez effectué une rotation complète de l'aiguille et injecter tout le contenu de la seringue. Pour de meilleurs résultats injecter un total de 10 uL de solution en utilisant une seringue de 10 uL étanche Hamilton.
9. Retirez l'embout de la seringue par le nerf. Laisser l'excès de liquide injecté qui a porté au reflux du nerf dans l'orbite, car cela forme un bassin supplémentaire pour l'absorption par les extrémités des axones.
10. Retourner le contenu orbitaire à leur position initiale, fermer la plaie, et permettre aux animaux de récupérer.
11. Post-chirurgicales analgésiques doivent être administrés selon les directives de vos autorités soins aux animaux, et les animaux doivent être surveillés avec attention après la chirurgie.

6. Les résultats représentatifs:

Injections intraoculaires cibler toutes les cellules de la rétine dans le monde, et bien travailler pour les substances livraison à CGR blessés depuis cellules ganglionnaires sont situés dans la couche la plus interne des neurones de la rétine, à côté de la chambre vitrée. CGR peut également être directement visés par la prestation des substances à la souche du nerf optique sectionné. CGR Fluorogold marqués de façon rétrograde peut être ciblée en utilisant des peptides, des médicaments, des vecteurs, des plasmides, ou ARNsi de la souche nerveuse comme l'illustre la figure 1. Figure 1A-C démontre la localisation d'un peptide Cy3 étiquetés dans la soma des CGR qui ont été pré-étiquetées en injectant dans le Fluorogold colliculus supérieur. Cy3 peptides marqués ont été injectées dans le nerf optique immédiatement après axotomie, et de la rétine a été imagée en vie afin de prévenir les peptides issus de la lixiviation du tissu lors de la fixation. Figure 1D-F montre la localisation des Cy3 siRNA étiquetés et le traceur rétrograde Fluorogold au CGR axotomisés. Cy3 siRNA marqués ont été injectés dans le tronc du nerf optique immédiatement après axotomie, et de la rétine a été imagé vivante.

Figure 1. Micrographies épifluorescence des CGR dans les rétines flatmounted à 1 jour après axotomie et l'injection de peptides soit étiqueté ou siRNA dans le tronc du nerf optique. (A) Fluorogold marquage rétrograde au CGR axotomisés au postaxotomy 1 jour (B) en fluorescence Cy3 CGR suivantes transport rétrograde de peptides marqués, 1 jour après axotomie et l'injection de peptide dans le nerf optique. (C) Superposition de (A) et (B) montrant la localisation sélective des peptides marqués au Cy3 CGR Fluorogold étiquetés. (DF) Les corps cellulaires des Fluorogold CGR étiquetés (D) sont également remplis de Cy3 siRNA marqués (E) injecté dans le tronc du nerf optique 24 heures plus tôt, comme le montre la superposition (F). La barre d'échelle dans le secteur est de 50 um. La barre d'échelle dans le DF est de 20 um.

Discussion

Transection du nerf optique est un modèle hautement reproductible de l'apoptose des neurones du SNC adulte. Les manipulations expérimentales ont démontré dans ce manuscrit permettre l'étude des mécanismes de l'apoptose RGC après une blessure.

Injections intraoculaires sont utiles pour cibler mondiale de la rétine. Cette procédure nécessite une certaine pratique, car il est essentiel de ne pas blesser la lentille avec la pointe de la pipette en verre. Endommager la lenti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT