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* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Ce protocole décrit les étapes nécessaires à disséquer, transfecter par électroporation et de neurones de souris de la culture de l'hippocampe et du cortex. Cultures à court terme peut être utilisé pour des études d'excroissance axonale et d'orientation, tout en cultures à long terme peut être utilisé pour des études de la synaptogenèse et l'analyse des épines dendritiques.
Neurones de l'hippocampe et le cortex ont été largement utilisées pour étudier le système nerveux central (SNC) la polarisation des neurones, l'axone / dendrite excroissance, et la formation des synapses et la fonction. Un avantage de la culture de ces neurones est qu'ils polarisent facilement, formant des axones et des dendrites distinctifs, sur un substrat en deux dimensions à des densités très faibles. Cette propriété rend extrêmement utile pour déterminer de nombreux aspects du développement neuronal. Par ailleurs, en fournissant conditionné glial pour ces neurones, ils continueront à se développer, formant connexions synaptiques fonctionnelles et survivre pendant plusieurs mois en culture. Dans ce protocole, nous présentons une technique de disséquer, de culture et de transfecter des neurones embryonnaires de souris de l'hippocampe et du cortex. La transfection est réalisée par électroporation ADN dans les neurones avant l'étalement via nucléofection. Ce protocole a l'avantage d'exprimer des protéines de fusion par fluorescence marqués au début de développement (~ 4-8h après le placage) pour étudier la dynamique et la fonction des protéines au cours excroissance axonale polarisation, et la ramification. Nous avons également découvert que cette transfection unique avant plaquage maintient marqués par fluorescence expression des protéines de fusion à des niveaux appropriés pour l'imagerie pendant toute la durée du neurone (> 2 mois en culture). Ainsi, cette méthodologie est utile pour étudier la localisation des protéines et la fonction à travers le développement du SNC avec peu ou pas de perturbations de la fonction neuronale.
1. Préparation des Lamelles et Chambers
2. Préparation de la dissection neuronale et milieu de culture
3. Préparation gliales corticales couche nourricière pour les cultures à long terme
4. Dissection corticale et / ou l'hippocampe et l'électroporation
5. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Vivre dans les neurones de l'hippocampe stades successifs de développement. Images appariées de représentant vivant neurones de l'hippocampe sont montrés à la fois comme une image de contraste interférentiel différentiel et une micrographie correspondante fluorescentes. Chacune de ces cellules a été transfectées avec EGFP-tubuline et DsRed2 dans des vecteurs pCAX. Les neurones ont été imagées à des jours suivants in vitro (DIV): Étape 1 (1div), Stade 2 (1div), Phase 3 (2DIV), étape 4 (11DIV) et l'étape 5 (32DIV). La barre d'échelle est 20μm.
Ce protocole de culture embryonnaire, les neurones de souris de l'hippocampe et du cortex a été développé comme une modification du protocole de banquier, qui utilise le rat neurones 1,2. Nous avons utilisé ce protocole pour la souris et les neurones en culture de hamster ainsi 3,4,5,6,7. Ce protocole fonctionne aussi bien pour les neurones de l'hippocampe et du néocortex fois et est similaire à un protocole publié par Meberg et Miller 8. Généralement, nous utilisons neurones de l'hippocampe à long terme de culture, car ils sont bien caractérisés et un système modèle plus établies. Par ailleurs, ils sont susceptibles de contenir une population plus homogène de neurones que néocortex. Cependant, les neurones du néocortex cultivés en utilisant ce protocole aussi survivre et de se différencier de façon similaire (données non publiées). Nous utilisons régulièrement neurones de l'hippocampe et le néocortex pour la culture à court terme. Dissection du néocortex se traduit également dans les neurones beaucoup plus élevés (1.5x10 6 neurones par paire de cortex) que la dissection hippocampique (2.5x10 5 neurones par paire de hippocampes), ce qui en fait un meilleur choix du matériau pour Western blot, par exemple.
Comme pour toute culture primaire, il est essentiel de minimiser le temps que cela prend de la mort de l'animal au bordé de cellules. Elle prendra généralement 10 à 20 dissections de devenir toujours rapide à la dissection et le placage. Aussi, lorsque vous travaillez avec le Nucleofector Lonza, il est essentiel de travailler rapidement pendant la procédure d'électroporation, comme la viabilité des neurones diminue rapidement si elles sont laissées dans la mémoire tampon nucléofection.
La plupart de nos images est réalisée avec un total de microscopie par fluorescence réflectance interne (TIRFM). Ce type de microscopie est seulement capable de l'imagerie plusieurs centaines de nanomètres au-delà des lamelle. Par conséquent, les zones des neurones qui nous avons souvent l'image, le cône de croissance axonal et des épines dendritiques, ont besoin d'être collée directement sur la lamelle. Ainsi, nous utilisons des cultures à faible densité qui nécessitent l'alimentation gliales pour la culture à long terme. Nous avons utilisé des cultures de densité plus élevée (> 2x10 4 cellules / cm 2), sans couches nourricières gliales, à long terme des cultures et a constaté qu'ils survivent très bien avec une alimentation peu. Cependant, les épines dendritiques de ces neurones sont souvent trop éloignés du substrat à l'image de TIRFM, même si elles peuvent être facilement détectés par microscopie à champ large ou de microscopie confocale.
Dans la plupart de nos études, nous transfecter des neurones, avant le placage, et ont imagé protéines marqués à la fluorescence pour un maximum de trois mois en culture. Cette expression à long terme des protéines marqués à la fluorescence nous donne confiance qu'en utilisant de faibles concentrations de l'ADN (1-2μg) nous ne produisons pas des artefacts surexpression dans les neurones. Cependant, cette procédure peut également être utilisé pour étudier la surexpression de protéines, si de grandes quantités d'ADN sont utilisées (10-20 pg). Les plasmides que nous utilisons pour transfecter des neurones contiennent habituellement des protéines de fusion EGFP ou mCherry, bien que nous avons aussi l'étiquette du cytoplasme neuronal avec DsRed2 ou EGFP seul. Cette technique d'électroporation fonctionne bien avec un certain nombre de vecteurs. Nous préférons les plasmides qui contiennent un promoteur β-actine avec un enhancer du CMV et de β-globine queue poly-A (ou pCAGGS pCAX plasmides) 9, en raison des niveaux relativement élevés d'expression, et le fait qu'ils sont bien tolérés par les neurones dans les deux cultures à court et à long terme. Généralement, les protéines commencent à exprimer au sein d'environ 4 heures de placage et atteindre un niveau suffisant pour l'imagerie dans les 10-24h 10. Nous avons utilisé avec succès CMV promoteur axée plasmides à court terme, les cultures, mais ils ont constaté qu'ils peuvent causer des niveaux élevés de surexpression qui tuent les neurones à long terme de la culture. Néanmoins, nous avons constaté que le conditionnement des cultures gliales faible densité contribue à la survie des neurones transfectées avec des plasmides promoteur CMV-conduit, par rapport à une densité plus élevée (non-gliales nourris) des cultures.
Toutes les procédures ont été approuvées par l'Université du Wisconsin Comité de protection des animaux et ont été en conformité avec les directives du NIH. Nous remercions le Dr Katherine Kalil pour l'utilisation généreuse de son dispositif de Nucleofector. Nous remercions également les membres du laboratoire de la Dent de commentaires sur le protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-NS064014, Dana Foundation et la Fondation de Whitehall EWD
Christopher Viesselmann, Jason et Derek Ballweg Lumbard contribué également à ce document.
* La plupart des réactifs que nous conserver à -80 ° C peuvent être stockés à -20 ° C ainsi. Leur stockage à -80 ° C allonge leur durée de vie et les résultats dans les cultures un peu plus cohérent.
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