Décellularisation et Recellularization des foies entiers

Résumé

Décellularisation perfusion est une nouvelle technique pour produire des échafaudages foie entier qui conserve la composition de l'organe de la matrice extracellulaire et la microarchitecture. Ici, la méthode de préparation d'échafaudages organe entier en utilisant décellularisation perfusion et le repeuplement ultérieur avec les hépatocytes est décrite. Greffes de foie fonctionnel et transplantables peuvent être générés en utilisant cette technique.

Résumé

Le foie est un organe complexe qui nécessite une perfusion constante pour la livraison de nutriments et d'oxygène et l'élimination des déchets afin de survivre à ^1. Les efforts pour recréer ou imitent la microstructure du foie avec des motifs en utilisant l'approche de l'ingénierie tissulaire et des techniques de microfabrication n'ont pas réussi jusqu'à présent à cause de ce défi de conception. En outre, les biomatériaux synthétiques utilisés pour créer des échafaudages pour les applications de l'ingénierie tissulaire du foie ont été limitées dans l'induction de la régénération des tissus et la réparation due en grande partie à l'absence de motifs de cellule de liaison spécifique qui induisent les fonctions cellulaires appropriées ^2. Tissus décellularisé natif vaisseaux sanguins et la peau tels ^{3 4} d'autre part ont trouvé de nombreuses applications en ingénierie tissulaire, et ont fourni une solution pratique à certains des défis. L'avantage de la matrice maternelle décellularisé est qu'il conserve, dans une certaine mesure, la composition originale, et la microstructure, et donc l'amélioration de la fixation des cellules et la réorganisation ^5.

Dans ce travail, nous décrivons les méthodes pour effectuer la perfusion-décellularisation du foie, tels qu'un foie intact bioscaffold qui conserve la structure des vaisseaux sanguins majeurs est obtenu. En outre, nous décrivons des méthodes pour recellularize ces biomatériaux avec un adulte hépatocytes primaires, la création d'une greffe du foie qui est fonctionnel in vitro, et a l'accès du navire nécessaires pour la transplantation in vivo.

Protocole

1. Décellularisation foie

1. Récolte d'un foie de rat avec canulation veine porte et de l'aide de calibre 18 cathéter. Laisser l'inférieur et la veine cave supérieure ouverte. Gardez l'organe hydraté dans du tampon phosphate salin (PBS) dans un plat de 10 cm de Pétri.
2. Mettre en place un système de perfusion qui se compose de réservoir de 8 litres, pompe péristaltique et un piège à bulles.
3. Remplir le système de perfusion avec une solution saline tamponnée de phosphate et le faire fonctionner pendant 10 minutes. Remplissez PBS dans un plat de 10 cm de Pétri et réduire le débit de tampon phosphate salin à 1 mL / min.
4. Transférer soigneusement le foie récoltés à l'tampon phosphate salin remplie de 10 cm boîte de Pétri.
5. Continuez avec une perfusion PBS pendant une nuit.
6. Démarrer la perfusion avec 0,01% (p / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) en eau distillée pendant 5 minutes.
7. Perfuser avec du PBS pendant 1 heure.
8. Répétez les étapes 1.6 et 1.7 plus de trois fois l'augmentation du temps de perfusion SDS à 10 minutes, 15 et 20 à chaque fois.
9. Poursuivre la perfusion avec 0,01% (p / v) de SDS pendant 24 heures.
10. Poursuivre la perfusion avec 0,1% (p / v) de SDS pendant 24 heures.
11. Perfuser avec 0,2% (p / v) SDS pendant 3 heures.
12. Perfuser avec 0,5% (p / v) SDS pendant 3 heures.
13. Perfuser à l'eau distillée pendant 15 minutes.
14. Perfuser avec 1% (p / v) de Triton X-100 dans l'eau distillée pendant 30 minutes pour enlever toute les acides nucléiques liés.
15. Pour laver le foie décellularisé matrice (DLM), perfuser avec du PBS pendant 2 heures.
16. En option: réséquer tous les lobes, sauf le lobe médian.
17. Stocker le DLM dans un bol propre et scellé Petri trempé dans du PBS à 4 ^° C jusqu'au moment de servir (figure 1).
18. Pour stériliser le DLM: 1) Rincer le DLM avec du PBS stérile contenant 0,1% (v / v) d'acide peracétique et de 4% (v / v) d'éthanol et incuber pendant 3 heures à 4 ^o C. 2) Laver avec du PBS stérile 2 fois. 3) Laver avec du PBS stérile contenant 2% de pénicilline-streptomycine, 10ug / ml de gentamicine, et 2,5 ug / ml d'amphotéricine B. Entreposer le foie décellularisé dans la même solution à 4 ^o C jusqu'au moment de servir pour des expériences recellularization.

2. Recellularization du foie décellularisé Matrice

1. Mettre en place un système de perfusion qui se compose d'une chambre de perfusion, la pompe péristaltique et d'un piège à bulles dans des conditions stériles. Remplir le système de perfusion avec 200 ml de milieu de culture, par exemple, le glucose élevé DMEM (Sigma), 10% sérum de veau foetal (Hyclone,), 100 U mL ^-1 pénicilline et 100 pg mL ^-1 streptomycine (Invitrogen).
2. Placer la matrice du foie décellularisé dans la chambre de perfusion et de connecter le DLM au système de perfusion à travers la canule la veine porte pendant que la pompe fonctionne à 5 mL / min pour éviter la formation de bulles d'air.
3. Laisser la perfusion du milieu à travers le DLM pendant 30 minutes.
4. Isoler des hépatocytes primaires à partir d'un rat adulte avec une viabilité d'au moins 90%.
5. Arrêter l'écoulement dans le système de perfusion et injecter lentement 50000000 hépatocytes (dans 1-3 ml de milieu de culture) dans le système de perfusion à travers le piège à bulles.
6. Démarrer le débit à 10 mL / min et recirculer la moyenne pendant 10 minutes.
7. Répétez les étapes 2.5 et 2.6 jusqu'à ce qu'un total de 200 millions de cellules sont introduites dans le DLM (figure 2) ^6.
8. Une fois que toutes les cellules sont perfusées dans le DLM, recueillir le perfusat en quatre tubes à centrifuger de 50 ml et centrifuger à 600 rpm pendant 10 minutes. Jeter le surnageant et collecter les pastilles dans un seul tube. Déterminer le nombre de cellules et la viabilité à travers exclusion du bleu trypan pour déterminer l'efficacité d'ensemencement.

3. Culture in vitro du greffon hépatique Recellularized

1. Mettre en place un système de perfusion qui se compose d'une chambre de perfusion, la pompe péristaltique, oxygénateur et un piège à bulles dans des conditions stériles (figure 3). Remplir le système de perfusion avec 50 ml de milieu de culture, par exemple, E Williams (Sigma), 5% sérum de veau foetal (Hyclone,), 0,5 U mL ^-1 insuline (Eli Lilly), 20 ng ml ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml ^-1 glucagon (Bedford Laboratories), 7,5 ug mL ^-1 d'hydrocortisone (Pharmacia), 100 U mL ^-1 pénicilline et 100 pg mL ^-1 streptomycine (Invitrogen).
2. Placez la greffe du foie recellularized dans la chambre de perfusion et de connecter le DLM au système de perfusion à travers la canule la veine porte pendant que la pompe fonctionne à 5 mL / min pour éviter la formation de bulles d'air.
3. Aseptiquement fermer la chambre de perfusion et fermez hermétiquement pour éviter toute fuite pendant la culture.
4. Transférer le système de perfusion d'un incubateur est de 37 ^o C et a 10% de CO ₂ et d'augmenter le débit de perfusion à 15 mL / min.
5. Connectez l'oxygénateur à un CO à 95% d'O ₂ et 5% ₂ réservoir de mélange de gaz et régler le débit de gaz de 0,5 litres / min. Cela devrait atteindre une pression partielle d'oxygène approximationListe des sites 400 mmHg.
6. La culture peut se poursuivre jusqu'à 10 jours avec les changements quotidiens de milieu de culture. Le milieu de culture peuvent être prélevés quotidiennement pour la surveillance des fonctions hépatiques de la greffe comme l'albumine, l'urée et la sécrétion d'acides biliaires totaux. A la fin de la période de la culture, la greffe du foie recellularized peuvent être échantillonnés pour l'analyse moléculaire et histologique.

4. Les résultats représentatifs:

La décellularisation complète d'un foie de rat prend environ 72 heures en utilisant le protocole décrit. La matrice résultante conserve 100% du collagène fibrillaire, 50% des glycosaminoglycanes et seulement 5% de l'ADN du foie natif (tableau 1) ^6. La structure vasculaire de la matrice est conservée comme en témoigne la corrosion coulée et la numérisation d'analyse microscopie électronique (figure 4) ^6. La présence de la microarchitecture vasculaires dans le DLM facilite son repeuplement avec des cellules avec un rendement de 96% et sa perfusion subséquente de culture in vitro. La greffe du foie recellularized peuvent être cultivées jusqu'à 10 jours in vitro et affiche les fonctions hépatiques bon que confirmé par l'albumine, l'urée et la sécrétion d'acides biliaires totaux (figure 5) ^6.

Figure 1. Décellularisé matrice de foie à la fin du processus de décellularisation. (A) la totalité du foie (b) le lobe médian après résection.

Figure 2. Représentation schématique de la recellularization du DLM.

Figure 3. Installation du système de perfusion pour la culture in vitro de la greffe du foie recellularized.

Figure 4. La structure microvasculaire est retenu dans la matrice du foie décellularisé. Images fonte due à la corrosion d'un) un foie normal b) un foie décellularisé, portail (rouge) et veineux (bleu) vascularisation. Numérisation d'images de microscopie électronique de la c DLM) un navire, d) une section avec des voies biliaires-comme les petits vaisseaux (flèches), barres d'échelle (a, b) 5 mm (c, d) 20 um.

Figure 5. Fonctions hépatiques spécifiques de la greffe du foie recellularized pendant la perfusion dans la culture in vitro. la production d'urée d'une sécrétion) albumine (p = 0,5249), b) (p = 0,5271) et c) la sécrétion d'acides biliaires totaux (p = 0,0114). L'analyse statistique de la différence entre l'expérience et le contrôle a été effectué au cours de la période de 10 la culture d par le test de Friedman à 0,01 =. Les barres d'erreur représentent SEM (n = 3).

	Frais Livera	Décellularisé foie matrice A	p-valeurs	% De foie frais
	n = 4	n = 8
Collagène	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0,56	114%
(Mg par g de foie)
Les glycosaminoglycanes	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0,004	47%
(Mg par g de foie)
L'ADN	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Mg par g de foie)

Tableau 1. La composition biochimique de la matrice du foie décellularisé par rapport à la foie natif.
^{a Les} valeurs sont représentées en moyenne ± SEM

Discussion

La méthode décrite ici décellularisation perfusion produit un foie entier d'échafaudage qui a la même structure brute et la microarchitecture vasculaires du foie natif. L'échafaud est une composition de la matrice extracellulaire semblable à du foie natif. La méthode recellularization réalise repeuplement de l'échafaud avec des cellules à haut rendement et les cellules restent viables et fonctionnelles pendant la période de culture in vitro testées. Avec l'ajout de cellules...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149