Course de modélisation chez la souris - Moyen-occlusion artérielle cérébrale avec le modèle filamentaire

Résumé

L'occlusion filamenteux de l'artère cérébrale moyenne est un modèle commun pour l'étude de l'AVC ischémique chez la souris.

Résumé

L'AVC est une des causes les plus fréquentes de décès et d'invalidité chez les adultes, en particulier dans les pays hautement développés. Cependant, les options de traitement à ce jour sont très limitées. Pour répondre au besoin de nouvelles approches thérapeutiques, de recherche expérimentale course emploie fréquemment des modèles de rongeurs d'ischémie cérébrale focale. La plupart des chercheurs utilisent une occlusion permanente ou transitoire de l'artère cérébrale moyenne (ACM) à des souris ou des rats.

Occlusion proximale de l'artère cérébrale moyenne (MCA) via la technique de suture intraluminale (dits de filaments ou d'un modèle de suture) est probablement le modèle le plus fréquemment utilisé dans la recherche expérimentale course. Le modèle intraluminale MCAO offre l'avantage d'induire une ischémie transitoire ou reproductibles permanents du territoire MCA d'une manière relativement non invasive. Des approches intraluminale interrompre le flux sanguin de l'ensemble du territoire de cette artère. Filament d'occlusion proximale de débit ainsi arrestations pour les artères lenticulo-striées, qui fournissent les noyaux gris centraux. Filament l'occlusion de la MCA résultats dans les lésions reproductibles dans le cortex et le striatum et peut être soit permanent ou transitoire. En revanche, les modèles induisant distale (à l'embranchement des artères lenticulo-striée) MCA occlusion généralement épargner le striatum et concernent principalement le néocortex. En outre, ces modèles ne nécessitent craniectomie. Dans le modèle montré dans cet article, un fil enduit de silicone est introduit dans l'artère carotide commune et avancé le long de la carotide interne dans le cercle de Willis, où il bloque l'origine de l'artère cérébrale moyenne. Chez les patients, les occlusions de l'artère cérébrale moyenne sont parmi les causes les plus fréquentes d'accident vasculaire cérébral ischémique. Depuis des intervalles variables ischémique peut être choisi librement dans ce modèle selon le point de temps de reperfusion, des lésions ischémiques avec des degrés de gravité peut être produite. Reperfusion par l'enlèvement du filament occultant au moins partiellement les modèles de la restauration du flux sanguin après spontanés ou thérapeutiques (tPA) lyse d'un caillot de thrombo-emboliques chez les humains.

Dans cette vidéo, nous allons présenter la technique de base ainsi que les écueils majeurs et les facteurs de confusion qui peut limiter la valeur prédictive de ce modèle.

Protocole

Pour garantir une haute qualité et de reproductibilité, nous recommandons l'utilisation de procédures opérationnelles normalisées (SOP). Dans cette vidéo, IPO a publié aussi développée et utilisée dans notre laboratoire sont appliquées ^1.

1. Occlusion Artère cérébrale moyenne

1. Les souris sont anesthésiées avec un régime approprié anesthésique consulter le personnel vétérinaire. (Par exemple, induction avec 1,5 - 2% isoflurane et de l'entretien avec 1,0 - 1,5% isoflurane dans 2 / 3 de N2O et 1 / 3 O2 aide d'un vaporisateur).
   1. La température corporelle des souris est maintenu à 36,5 ° C ± 0,5 ° C pendant une intervention chirurgicale avec une plaque chauffante. Un coussin chauffant rétroaction contrôlée, ce qui réchauffe en fonction de la température rectale de la souris, est fortement recommandée.
   2. Désinfecter la peau et la fourrure entourant avec un agent approprié (par exemple l'alcool éthylique à 70%) et le sécher ensuite.
2. Une incision est faite ligne médiane du cou et les tissus mous sont séparés.
3. L'artère carotide commune gauche (ACCV) est soigneusement disséquée par les nerfs environnants (sans nuire au nerf vagal) et une ligature est faite en utilisant 6.0/7.0 chaîne. Chaîne de 5.0 peut également être utilisé.
4. La gauche l'artère carotide externe (LECA) est ensuite séparé et un second nœud est fait.
5. Ensuite, l'artère carotide interne gauche (LICA) est isolé et un noeud est préparé avec un filament de 6,0.
6. Après l'obtention de bonne vue de l'artère carotide interne gauche (LICA) et l'artère ptérygo (APL), les deux artères sont coupées, à l'aide d'un clip microvasculaires.
7. Un petit trou est coupé dans la LCCA avant qu'il ne bifurque à l'LECA et la LICA. Un monofilament en nylon enduit avec 8,0 mélange durcisseur de silicium (voir ci-dessous) est alors introduit dans la LICA, jusqu'à ce qu'il s'arrête à la pince. Attention, doit être payé à ne pas saisir l'artère occipitale. (Figure 1)
8. Les artères coupées sont ouvertes tandis que le filament est inséré dans la LICA pour occlure l'origine de la LMCA dans le cercle de Willis.
9. Le troisième noeud sur la LICA est fermé pour fixer le filament en position.
10. Les souris reçoivent une solution saline 0,5 ml par voie sous cutanée que réapprovisionnement en volume. Pour soulager la douleur, lidocaïne gel est appliqué localement dans la plaie.
11. Si la reperfusion est destiné, souris séjour pour 30 à 90 min d'occlusion dans une cage chauffée, la blessure pourrait être fermé avec un clip de suture petits. Ensuite, une deuxième anesthésie est effectuée, le troisième noeud sur le ICA est momentanée ouvert et le filament retirée.
12. Les sutures restantes sont raccourcis et la peau est adaptée avec une suture chirurgicale.
13. Tous les animaux reçoivent une reconstitution second volume tel que décrit ci-dessus.
14. Les animaux sont mis dans une cage chauffée pendant deux heures pour contrôler la température du corps.
    1. Les animaux doivent être contrôlés quotidiennement après la chirurgie pour des signes d'inconfort. Les souris pourraient montrer une certaine perte de poids post-chirurgicales. Ils reçoivent de la nourriture en purée dans un boîte de Petri placées sur le plancher pour l'encourager à manger. La nourriture est remplacé par jour pendant sept jours.

2. Sham Fonctionnement

1. Pour les opérations de simulacre le filament est inséré à occlure LMCA et retiré immédiatement pour permettre la reperfusion instantanée (1,8). L'opération suivante est identique à celle pratiquée sur les animaux subissant une ischémie cérébrale (01.09 à 01.14), y compris une seconde anesthésie.

3. Préparation du filament

1. Stérilité du filament doit être envisagée. L'utilisation de l'équipement stérilisé ainsi que d'un traitement approprié du filament est ensuite une condition préalable à une chirurgie stérile. Désinfection du filament est difficile, car la plupart des méthodes de stérilisation commune peut nuire à la qualité du filament. Cependant les méthodes telles que le rayonnement, par exemple avec une lumière UV ou les rayons γ, ou la stérilisation chimique, par exemple avec des gaz hautement réactifs tels que l'oxyde d'éthylène, sont applicables.
2. 8,0 filaments de nylon est coupé en longueurs de 11 mm sous le microscope
3. La pointe filament doit être revêtue complètement et uniformément sur une longueur de 8 mm avec un mélange durcisseur de Xantopren M muqueuse et Activator NF Optosil

4. Les résultats représentatifs

Selon la durée de la restriction du flux sanguin, le moteur différentes et de comportement résulte des déficits. Les deux après 30 et 60 min d'ischémie cérébrale, les animaux dans la plupart des cas présentent une résistance réduite à poussée latérale et indirecte en raison de perturbations dans la locomotion. Milder manifestent des lésions comme une position fléchisseurs de l'avant liMBS. Ces signes facilement observables peut être utilisé comme un score de base pour le succès de l'opération ^2.

Morphologiquement la lésion peut être évaluée en utilisant soit l'histologie ou l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Soixante minutes d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne produit pannecrosis tissus dans une zone comprenant à la fois le striatum et le néocortex, alors que 30 minutes d'ischémie provoquer la mort cellulaire neuronale essentiellement limitée dans le striatum. ³ (figure 2) En termes de volume de l'infarctus, nous nous attendons une déviation standard inférieure à 30% en un ensemble d'opérations. La mortalité dépend du temps d'occlusion avec près de 5% après 30 min d'ischémie et 10 - 20% après 60 min.

Une autre possibilité minimale invasive est l'utilisation de laser Doppler (LDF) pendant l'opération, ce qui permet un contrôle direct de son succès. Dans un animal en particulier, la réduction à 10 - 20% des valeurs preocclusion indique clairement l'induction réussie d'une ischémie cérébrale focale ⁴ Toutefois, LDF ne peut pas être utilisée comme une méthode pour les comparaisons interindividuelles, depuis FDL ne peut mesurer les changements quantitatifs (en pourcentage) de sang. écoulement dans un volume d'échantillon de tissu de petites et limitées. Il ne donne pas d'information sur l'étendue spatiale de la réduction du flux sanguin. ⁵

Il existe plusieurs tests pour évaluer les aspects comportementaux après un AVC, y compris la démarche d'analyse ^6,7, Rotarod ^8, Pôle de test ^9,10, test de suppression adhésive ^{11,12, 13,14} test de l'escalier, le test barreau d'échelle et de ^15,16 labyrinthe d'eau de Morris ^17. Dans tous ces tests, les souris soumises à MCAo effectuent moins de succès que les animaux témoins.

Figure 1. Schéma de l'architecture des navires irriguant le cerveau (représentée en arrière-plan) chez la souris. Différentes souches peuvent présenter des variations, par exemple l'artère occipitale laisse parfois de l'artère carotide interne.

Figure 2. Illustration schématique de la taille des lésions typiques après différents temps de la reperfusion dans le modèle proximale MCAo. Au milieu, le parcours typique de l'activité fonctionnelle et le débit sanguin cérébral après MCAo sont représentés. (MCAo: artère cérébrale moyenne d'occlusion, LDF: mesure laser Doppler)

Discussion

Le modèle de transitoire, occlusion proximale MCA ^18,19 présenté imite ici l'un des types les plus communs de l'AVC ischémique chez les patients. Basé sur ²⁰ heures de reperfusion variable, le modèle propose différentes qualités de dommages allant de l'attaque ischémique transitoire (AIT) à grande infarctus, y compris de grandes parties de l'hémisphère ischémique. Cela permet au chercheur d'étudier différents mécanismes physiopathologiques après un AVC. ^20,21

La chirurgie peut être réalisée dans un court laps de temps et produit des lésions hautement reproductibles. Néanmoins, cela nécessite un contrôle approfondi des facteurs confondants. ²² petites différences dans la technique de l'exploitation peut tenir compte des effets différents sur l'infarctus. ^23,24 De plus, en raison de variations dans l'anatomie vasculaire cérébral, différentes souches de souris montrent un résultat différent. ^25,26 Body température affecte dommages neurologiques, avec une hypothermie menant à des lésions plus petites ²⁷ et hyperthermie à plus de graves déficits. ^{28 En} conséquence de contrôle de température, et l'entretien est très pertinente dans ce modèle. ²⁹ En outre, la pression sanguine et les gaz du sang sont les facteurs de confusion importants du résultat et la nécessité de être surveillés. ^30,31 L'utilisation de méthodes rapides et peu invasive (mesure non invasive de la pression artérielle, adapté et facilement accessible des sites de collecte du sang) est recommandé. Le choix de l'anesthésique est également très important, car certains peuvent avoir des effets neuroprotecteurs et / ou être vasodilatateurs, comme par exemple l'isoflurane. ^{32 Par} conséquent, l'exposition à l'anesthésie doit être aussi courte que possible et standardisés. Nous excluons les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale pendant plus de 15 min.

Rasage du site opératoire produit microabrasions et l'inflammation et des communiqués de fragments de cheveux. Cela peut encore augmenter l'inflammation et de favoriser une infection locale, qui peuvent avoir une incidence sur la physiopathologie course. Les conditions de logement, en particulier l'utilisation de l'enrichissement, pourrait affecter les résultats de l'AVC et devrait être standardisé et décrits dans les rapports de recherche. ^6,33,34 L'utilisation de l'enrichissement de l'environnement et ses effets sur la reproductibilité est un sujet de discussion. ³⁵ Un autre facteur de confusion important est le course des risques induits par l'infection en particulier après des durées plus longues de l'ischémie ^36, ce qui conduit à une morbidité et une mortalité accrue supplémentaires. ^37,38 Comme les infections deviennent symptomatiques à environ 3 à 5 jours, cela a des conséquences importantes pour le long terme le suivi de ces modèles.

Pour produire des résultats pertinents pour le développement de nouvelles stratégies de traitement de l'AVC, la normalisation et de contrôle de qualité est très importante dans la recherche préclinique course de translation ³⁹ "Bonnes Pratiques de Laboratoire" ^40,41 mandats.:

1. une description appropriée et détaillée des animaux utilisés;
2. Calcul de la taille de l'échantillon et les rapports sur l'ampleur de l'effet attendu;
3. critères d'inclusion et d'exclusion, mis en place avant l'étude;
4. randomisation de l'affectation dans les groupes;
5. dissimulation de l'affectation à l'égard des enquêteurs;
6. rapports des animaux exclus de l'analyse;
7. évaluation en aveugle des résultats;
8. déclaration des conflits d'intérêt potentiels et le financement d'études.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical scissors (skin cut)	Fine Science Tools	14028-10
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip)	Fine Science Tools	11253-20
Spring scissors (according to Vannas)	Fine Science Tools	15000-00
Applying forceps for micro clamps	Fine Science Tools	00072-14
Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V)	Fine Science Tools	00396-01	Also Serrefine possible
2 Hemostats according to Hartmann	Fine Science Tools	13002-10
Needle holder (according Olsen-Hegar or other)	Fine Science Tools	12002-14
Standard anatomical forceps (for wound closure)	Fine Science Tools	11000-12
5/0 sutures	Suprama		for vascular ligatures
6/0 sutures	Suprama		for skin suture, 5/0 also possible
Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%)	AstraZeneca		or other local pain relief
Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x	Leica Zeiss	MZ6 Stemi2000C
Cold light source	Leica Microsystems	KL1500
Temperature feedback controlled heating pad system	Fine Science Tools	21052-00	With mouse pad and small probe
Anaethesia system for isoflurane
Isoflurane	Abott
Veterinary Recovery Chamber	Peco Services	V1200	Heated cage
8.0 nylon filament	Suprama	TEL181005	for coating
Scalpel			For cutting filament in pieces
Ruler			To cut correct length of filament
Xantopren M Mucosa	Heraeus Instruments
Activator Universal Plus	Heraeus Instruments		Optosil - Xantopren
2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip)	Fine Science Tools	11253-20
A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments			e.g. swabs, foam, …
Receptacle for new build filaments			e.g. petri dish, flexible foam,…