Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons

Résumé

ARN interférence a été prouvé très efficace pour analyser la fonction des gènes dans Drosophile Développement trachéale. Un protocole détaillé utilisé par Jiang laboratoire pour injecter des ARNdb dans des embryons voler à l'expression des gènes knockdown est illustré. Cette technique a le potentiel pour le dépistage des gènes nécessaires au développement des tissus et des organes de Drosophile.

Résumé

Le dépistage génétique est l'une des méthodes les plus puissants disponibles pour obtenir un aperçu dans le processus biologique complexe ^1. Au fil des ans de nombreuses améliorations et d'outils pour la manipulation génétique sont devenues disponibles chez la drosophile ^2. Peu après la découverte initiale par Frie et Mello ³ qui ARN double brin peut être utilisé pour knockdown l'activité des gènes individuels chez Caenorhabditis elegans, l'interférence ARN (ARNi) a été montré pour fournir une puissante approche de génétique inverse afin d'analyser les fonctions des gènes chez la drosophile organes de développement ^{4, 5.}

De nombreux organes, notamment du poumon, du rein, le foie et le système vasculaire, sont composés de réseaux ramifiés tubulaire transport de fluides vitaux ou de gaz ^{6, 7.} L'analyse de la drosophile la formation trachéale fournit un excellent modèle pour étudier la morphogenèse des autres organes tubulaires ^8. Le Berkeley Drosophila Genome Project a révélé des centaines de gènes qui sont exprimés dans le système de la trachée. Pour étudier le mécanisme moléculaire et cellulaire de la formation du tube, le défi est de comprendre le rôle de ces gènes dans le développement de la trachée. Ici, nous avons décrit une méthode détaillée d'ARNdb injection dans l'embryon de drosophile à l'expression des gènes knockdown individuels. Nous avons réussi à renverser l'expression des gènes endogènes dysfusion (dys) par injection ARNdb. Dys est une protéine bHLH-PAS exprimée dans les cellules trachéales de fusion, et il est nécessaire pour la branche trachéale de fusion ^{9, 10.} dys-RNAi complètement éliminé l'expression dys et a abouti à la fusion anomalie trachéale. Cette méthode relativement simple fournit un outil pour identifier les gènes requried pour tissure et le développement des organes chez la drosophile.

Protocole

1. Collecte d'embryons

1. Mettre en place des cages à 25 ° C en utilisant 2-4 jours âgé w ¹¹¹⁸ plaques de jus flies.Grape sont changés tous les heures pendant la journée pour synchroniser le ramassage des œufs pendant 1-2 jours avant la collecte période
2. Recueillir des embryons pour 1h à 25 ° C
3. Couper une pièce rectangulaire d'agar jus de raisin, coupe légèrement au milieu avec une lame de rasoir, de laisser une ligne dans la gélose
4. Utiliser une sonde métallique de transférer les embryons de la plaque de jus de raisin à votre morceau de agar jus de raisin, les aligner dans une ligne droite avec axe long de l'embryon angle de 45 degrés à la ligne dans le milieu de l'agar. Obtenir une ligne droite d'environ 50 embryons. Assurez-vous que tous les points embryons dans la même direction, avec extrémité postérieure pointant loin de la ligne.
5. Couper une pièce rectangulaire de ruban adhésif double, et il place pour une lamelle 18x18mm.
6. Ramassez embryons avec du ruban adhésif double bâton sur la lamelle
7. Placer la lamelle sur une lame de verre, sèche l'embryon dans l'air pendant environ 10 min.
8. Couvrir l'embryon d'une fine couche d'huile de 700 sur les halocarbures, il est maintenant prête pour l'injection.

2. En tirant l'aiguille

Faire des aiguilles de microinjection en tirant des tubes capillaires en verre. Nous utilisons un extracteur aiguille de l'instrument de précision du monde (Modèle PUL-1). Les spécifications d'aiguille extracteur programme sont: la chaleur: 1, délai 4.

3. Remplir les Aiguilles

Retour à vide en utilisant les aiguilles Eppendorf p20 pipettes munies d'embouts Microloader Eppendorf, normalement la charge de 1,5 à 2 uL ARNdb

4. Cassez les Aiguilles

1. Avant de rompre l'aiguille, placer une lamelle sur une lame.
2. Préparer une diapositive avec une goutte d'huile dans le milieu de la diapositive
3. Allumez le picopump Picospritzer III pour ajuster la pression de l'air
4. Casser l'aiguille remplie contre le bord d'une lamelle, la création d'une pointe acérée.
5. Lorsque la pointe est cassée, pas sur la pédale d'Picospritzer III picopump, certains ARNdb aura une fuite hors de la pointe de l'aiguille.
6. Sortez la lame avec la lamelle.
7. Insérer l'aiguille sous la goutte d'huile dans le milieu de la diapositive préparée avant.
8. Réglez le paramètre sur la picopump Picospritzer III pour obtenir 100-200PL ARNdb lorsque vous appuyez sur la pédale. ARNdb peut être vu comme une petite goutte.

5. Injection

1. Apportez la pointe de l'aiguille à la partie postérieure de l'embryon de blastoderme d'abord dans le même plan focal et injecter l'embryon hors du centre de longueur environ 30-50% d'oeuf.
2. Après vous faites un pas sur la pédale de l'picopump Picospritzer III, une petite quantité d'ARNdb apparaîtra comme un petit point au site d'injection.

6. Analyse phénotypique

1. Après l'injection, placer la lame dans une chambre humide couverte (une boîte de Pétri en plastique) à 18 ° C jusqu'à ce que les embryons se développent jusqu'au stade désiré embryonnaire.
2. Utilisez la sonde pour chasser les embryons de l'adhésif double face et de les pousser vers le bord de la lamelle.
   Laver les embryons de la lame dans un flacon collection avec filet de nylon à la base en utilisant l'heptane, laver 3 fois avec le PBT.
   Embryons Dechorionate l'eau de Javel à 50% pendant 5 min, et laver 3 fois avec le PBT.
   Transfert des embryons à partir du flacon de collecte à un morceau de filet de nylon, puis tremper le filet de nylon dans la solution de fixation (5 ml d'heptane, 4,5 ml de PBS, le formaldéhyde 0.5ml 37%) pour libérer les embryons. Fixer des embryons dans la solution de fixation pour 30min.
   Devitellinize embryons avec du méthanol, le transfert des embryons dans un tube Eppendorf et immunocoloration des embryons en utilisant des protocoles standard.
3. Les embryons peuvent également développer au stade larvaire approprié.
4. Préparer une diapositive avec une goutte d'huile sur les halocarbures 700 dans le milieu
5. Transférer une larve à la diapositive, mettez une lamelle sur le dessus
6. Observez les larves sous microscope en champ clair.

7. Les résultats représentatifs:

Un exemple d'ARNdb renverser dysfusion (dys) gène dans l'embryon Drosophlia est montré dans Fig1. GFP-ARNdb embryons injectés sont le contrôle négatif. Dys est un facteur de transcription bHLH PAS exprimée dans les cellules de fusion trachéale. GFP-ARNdb embryons injectés montrent normale de fusion de la trachée et des protéines Dys est présent dans les cellules de fusion (figure 1A). D'autre part, la dys-ARNdb injecté embryons montrent la fusion branche échoué, et les protéines Dys ne sont pas présents dans les cellules de la fusion (figure 1B). Lorsque ARNdb injecté embryons se développent au stade larvaire, les larves dys-ARNdb injecté montré la fusion branche échoué (Fig.1D) par rapport à la GFP-contrôle négatif ARNdb injecté (figure 1C). Ces résultats ont montré efficaces renverser l'expression des gènes endogènes dys par ARNdb injection dans des embryons de drosophile

Figure 1. Suppression de la fonction dys par dys-RNAi révèle la fusion d trachéaleefects. Embryons de blastoderme (w ¹¹¹⁸⁾ ont été injectés soit avec GFP-ARNdb (contrôle négatif) ou dys-ARNdb et analysés pour les défauts trachéale. (A) Etape 16 embryons injectés avec GFP-ARNdb et colorées avec α-Dys et MAb 2A12 que les taches de la lumière trachéale. Bien en vue est le tronc latéral, qui a fusionné. Les flèches indiquent les cellules latérales du tronc de fusion Dys-positif. (B) Étape 16 embryons injectés avec dys-ARNdb et colorées avec α-Dys et MAb 2A12. L'embryon a montré une absence de fusion du tronc latéral (l'astérisque indique l'emplacement normal d'une fusion latérale du tronc chez les embryons de contrôle). Pas de cellules Dys-positives ont été observées, indiquant que la dys-ARN effectivement aboli en protéines Dys. (C à D) Deuxième stade larvaire soit avec GFP-ARNdb ou dys-ARNdb ont été examinés par microscopie à champ lumineux des défauts trachéale. (C) Sites de fusion sont indiqués par un astérisque dans la GFP ARNdb larves de contrôle injecté. (D) Le tronc latéral échoué à fusionner dans les larves dys-ARN injecté, (*) indique l'emplacement normal d'une fusion du tronc latéral.

Discussion

La présente méthode d'injection permet ARNdb ici une analyse très sensible et rapide de la fonction des gènes chez la drosophile développement trachéale. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour analyser la fonction des gènes d'autres tissus et le développement d'organes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007