Mesure Caenorhabditis elegans à 96 plaques de microtitration bien

Résumé

Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour mesurer Caenorhabditis elegans Durée de vie de 96 plaques de microtitration bien.

Résumé

Durée de vie est un processus biologique réglementé par plusieurs voies génétiques. Une stratégie pour étudier la biologie du vieillissement est d'étudier les animaux que les mutations portuaires dans les composants de l'âge réglementaire voies. Si ces mutations perturbent la fonction de la voie de l'âge réglementaire et donc modifier la durée de vie de l'organisme entier, ils fournissent des indications importantes mécanistes ^1-3.

Une autre stratégie pour étudier la régulation de la durée de vie est d'utiliser de petites molécules pour perturber l'âge réglementaire voies. À ce jour, un certain nombre de molécules sont connues pour prolonger la durée de vie dans des organismes modèles différents et sont utilisés comme outils pour étudier la biologie du vieillissement ^4-16. Le nombre de molécules identifiées à ce jour est petite par rapport à la génétique "outils" qui est disponible pour étudier la biologie du vieillissement.

Caenorhabditis elegans est un des modèles principe utilisé pour étudier le vieillissement en raison de son excellente et la génétique courte durée de vie de trois semaines. Plus récemment, C. elegans est apparu comme un organisme modèle pour les écrans de phénotype médicament à base ^5,7,16-20 raison de sa petite taille et sa capacité à croître dans les plaques de microtitration.

Nous présentons ici une analyse pour mesurer la durée de vie C.elegans en plaques de 96 puits de microtitration. Le test a été développé et utilisé avec succès à l'écran les grandes bibliothèques de molécules qui prolongent la durée de vie C.elegans ^7. La fiabilité du test a été évalué dans les tests multiples: d'abord, en mesurant la durée de vie des animaux de type sauvage cultivé à différentes températures, en deuxième lieu, en mesurant la durée de vie des mutants avec la durée de vie altérée, le troisième, en mesurant les changements dans la durée de vie en réponse à différentes concentrations de l'mirtazépine antidépresseur. Mirtazépine a déjà été démontré à prolonger la durée de vie de C.elegans ^7. Les résultats de ces tests montrent que le dosage est capable de répliquer les résultats précédents des dosages d'autres et est quantitative. Le format de microtitration rend également ce dosage durée de vie compatible avec les systèmes automatisés de manipulation des liquides et permet l'intégration dans les plates-formes automatisées.

Protocole

Aperçu: Le protocole est divisé en quatre parties. La Partie 1 décrit la façon de préparer les bactéries alimentaires. Partie 2 décrit comment préparer la culture ver. Partie 3 décrit comment marquer la durée de vie. Partie 4 montre quelques résultats représentatifs, et la partie 5 explique comment préparer les solutions nécessaires. Expériences Lifespan prendre plusieurs semaines à compléter. Pour chaque étape de la semaine du protocole, le jour et l'heure du jour est inclus pour faciliter la planification. Le stade L4 (jour 0) est utilisé comme point de référence pour l'ensemble du protocole.

1. Préparation de bactéries d'alimentation

Cette section décrit la préparation de la bactérie se nourrir. L'spécifiques E. coli souche utilisée pour nourrir C.elegans est appelé OP50. Avant de ce protocole, afin de prévenir la contamination croisée de la culture vers d'autres bactéries, la souche OP50 a été faite carbénicilline / résistantes à l'ampicilline ^21. Préparer les quatre à cinq jours à l'avance OP50. Tous les matériaux entrant en contact avec OP50 doit être stérile.

Jour -7: Le jeudi (semaine 1): Inoculer 5 ml de TB contenant 100 ug / ml d'ampicilline et 0,1 pg / ml d'amphotéricine B avec une seule colonie, OP50 et incuber pendant la nuit à 37 ° C dans un agitateur bactérienne.

Jour -6: Le vendredi (semaine 1).

Matin 8h30. Inoculer tôt pour laisser suffisamment de temps pour la culture pour atteindre la saturation

1. Diluer la culture de nuit de OP50 1:2000 dans 300 ml de tuberculose contenant 50 pg / ml d'ampicilline. Incuber la culture bactérienne dans un shaker pour 8-12 heures à 37 ° C jusqu'à saturation est atteint. Ne pas laisser la culture à croître de plus de 14 heures.
2. Transférer la OP50 dans une stérile, tube de centrifugation de pré-pondérées. Pellet l'OP50 par centrifugation pendant 10 min à 3500 rpm (2200 xg) dans une centrifugeuse de table.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot OP50 dans l'eau stérile et re-par centrifugation. Répéter ce lavage deux fois.
4. Après le second lavage, retirez soigneusement toute l'eau restante. Pas d'eau doit être laissé dans le tube. Peser le tube de centrifugation contenant le culot et soustraire le poids du tube de centrifugation vide afin de déterminer le poids de la pastille.
5. Bien re-suspendre le culot dans S-complet à une concentration de 100 mg / mL. Pas de touffes doivent être à gauche.
6. La concentration de 100 mg / mL OP50 doit correspondre à 2 x10 ¹⁰ bactéries / ml. Utilisez un spectromètre photo pour déterminer le nombre de bactéries par ml, si la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries par ml est connue. Si nécessaire, ajuster la concentration de la solution d'alimentation OP50 à 2 x10 ¹⁰ bactéries / ml.
7. Stocker le OP50solution à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour la culture ver.

2. Préparation d'une culture Worm Synchrone

Cette section décrit la préparation de la culture ver. Son objectif est de générer une population en âge-synchrone de vers. Tous les matériaux entrant en contact avec C.elegans après le traitement de blanchiment dans l'étape 5 doivent être stériles. Les plaques sont maintenues à 20 ° C, sauf indication contraire.

Jour -6: Le vendredi (semaine 1), 16h00: Transfert des animaux à une plaque fraîche

1. Prenez une plaque 5-10 jours NGM ancienne sur laquelle la majorité de la population de vers se compose de larves L1 affamés.
2. Stériliser une spatule en métal par le chauffant peu plus d'un bec Bunsen. Laissez-le refroidir. Utilisez la spatule refroidi pour découper des morceaux de la plaque de gélose contenant des vers affamés. Transfert de plusieurs de ces morceaux sur une nouvelle tête de série 10 cm avec plaque de NGM OP50. Incuber pendant env. 65 heures à 20 ° C jusqu'à ce que la majorité de la population de vers se compose d'adultes gravides. Le temps qu'il faut pour les animaux affamés L1 pour devenir des adultes gravides peuvent varier d'une souche à l'.

-3 Jour: lundi (semaine 2) 10h00: Établir une population synchrones

3. Recueillir les vers de la plaque de 10 cm en les lavant la plaque avec 5-10 mL d'eau stérile. Transférer la solution ver / eau dans un tube de 15 ml conique.
4. Lavez les vers par centrifugation 2 min dans une centrifugeuse de paillasse à 1200 rpm (280 xg). Rejeter le surnageant et ajouter 10 ml d'eau. Répéter.
5. Retirer le surnageant et ajouter 5 ml d'eau de Javel fraîchement préparés / solution de NaOH (2,5 ml de javel, 1 ml de NaOH 10N, 6,5 mL de H ₂ O). Incuber pendant 5 minutes à température ambiante jusqu'à ce que le ver casser. Soyez sûr de vortex en douceur à chaque minute. Surveiller l'avancement de la réaction sous la loupe binoculaire.
6. Dès que tous les adultes se dissoudre, ajouter 5 ml de tampon M9 pour neutraliser la réaction.
7. Laver les œufs à trois reprises avec 10 ml de tampon M9 par centrifugation 2 min à 2500 rpm (1100 xg).
8. Lavez les oeufs une fois avec 10 ml de S-complet par centrifugation 2 min à 2500 rpm (1100 xg).
9. Retirer le surnageant, ajouter 10 ml de S-complet et transférer la solution dans un nouveau tube conique de 50 mL. Ajouter 30 ml de S-complet d'un volume final de 40 ml. Agitez doucement le tube à température ambiante durant la nuit sur un nutator ou un appareil similaire.

Jour -2: mardi (semaine 2), 12h00: semences des animaux en plaques

10. Sous le microscope à dissection, vérifiez si les vers éclos durant la nuit. Déterminer la concentration de vers dans la solution S-complet en comptant le nombre de vers dans 10 gouttes uL utilisant un microscope à dissection. Comptez au moins 10 gouttes pour chaque échantillon.
11. Re-suspendre les vers à une concentration de 80-100 vers / ml à S-complet. Ajouter carbénicilline (stock de 100 mg / mL) à une concentration finale de 50 pg / mL et l'amphotéricine B (stock 250 pg / mL) à une concentration finale de 0,1 pg / mL. Agiter sur un nutator. Si la préparation de grandes quantités de vers, utiliser un flacon de 600 ml avec bouchon Nunclon filtre.
12. A 14h30 ajouter le OP50 préparés dans la partie 1 à une concentration finale de 6 mg / ml (= 1,2 x 10 ⁹ bactéries / ml). Retourner le OP50 à 4 ° C.
13. Transfert 120 ul de la solution worm/OP50 dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Utiliser des plaques 96 puits avec un fond transparent. Veillez à garder les vers en suspension pendant le pipetage.
14. Sceller la plaque en utilisant un scellant bande pour éviter la contamination et l'évaporation. Agiter la plaque sur un agitateur de plaques de microtitration pendant 2 min et laisser incuber pendant 2 jours à 20 ° C jusqu'à ce que les animaux atteignent le stade L4.

Jour 0: jeudi (semaine 2) avant midi: Stériliser les animaux en ajoutant fluorodésoxyuridine (FUDR)

15. Pour stériliser les animaux ajouter 30 ul d'une solution 0,6 mM FUDR stock à chaque puits. Cette étape amène le volume final dans chaque puits à 150 ul et réduit la concentration finale de OP50 partir 6mg / ml à 5 mg / ml (1x10 ⁹ bactéries / ml). Sceller la plaque à l'aide de bandes scellants et secouez pendant 2-3 min sur un agitateur de plaques de microtitration. Si l'OP50 a été ajouté à 2:30 le jour -2, il est important que les FUDR est ajouté avant midi. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C

Jour 1: Vendredi (semaine 2): Ajouter des drogues à la culture

16. En 9h00 la plupart des animaux doivent être gravides et contiennent plusieurs ovules chacune. Ajouter les médicaments dont l'effet sur la durée de vie est d'être testé à la concentration voulue. Si la dissolution de la drogue dans le DMSO, les concentrations finale de DMSO ne devrait pas excéder 0,6%, car les concentrations de DMSO supérieur à 0,6% de raccourcir la durée de vie C.elegans. Après addition de la drogue, sceller les plaques avec un scellant la bande et le secouer pendant 2-3 min sur un agitateur de plaques de microtitration. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C
17. Ajout de la drogue peut parfois tuer quelques animaux par assiette, surtout si vous utilisez un autre solvant que l'eau. Utiliser un microscope inversé pour vérifier les animaux morts. Généralement, il devrait y avoir moins de 10 animaux morts par plaque de 96 puits. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C.

Jour 4: lundi (semaine 3): Changement scellants

18. Pour permettre à l'oxygène frais pour entrer dans la culture enlever le scellant, attendre 1 minute et sceller la plaque. Agiter la plaque pendant 2-3 minutes sur un agitateur de plaques de microtitration. Répéter une fois par semaine.

Jour 5: Mardi (semaine 3): Ajouter de nouvelles OP50 pour éviter la famine

19. Ajouter 5 uL de la 100 mg / ml solution OP50 qui a été préparé dans la partie 1 à chacun des 96 puits pour éviter la famine.

3. Notation de durée de vie.

Cette section décrit comment la survie de la population de vers synchronisée de la partie 2 est surveillé jusqu'à ce que les animaux morts. Pour observer les animaux dans les plaques de 96 puits, l'utilisation d'un microscope inversé avec un objectif 2x ou 2.5x. Les données de survie record trois fois par semaine; lundi, mercredi et vendredi. Utilisez le mouvement afin de déterminer si les animaux sont vivants ou morts. Une forte lumière, la lumière bleue en particulier, induit les animaux à se déplacer. Ne pas retirer les animaux morts à partir du dosage. Parfois, les animaux qui ne bougeait pas et étaient déterminés morts au comptage précédent pourrait passer par la suite.

1. Au jour 0, au début de l'expérience de compter le nombre total de vers dans chaque puits. Censeur des puits qui contiennent plus de 18 animaux de l'analyse comme des animaux dans ces puits ne sera pas assez OP50 et montrer les effets de la restriction alimentaire.
2. Afin d'augmenter les chances que les animaux se déplacent secouer la plaque à 96 puits sur un agitateur de plaques de microtitration pendant 2 min. avant le comptage.
3. Dans chaque session, d'enregistrer la date et le comptage du nombre d'animaux quidéplacer comme les animaux vivants. Mouvement dans le liquide est beaucoup plus facile que sur un support solide et peut être induite par les lumières fortes. L'utilisation d'un plus fort grossissement peut aider à repérer des mouvements très subtils comme ceux de la pointe du pharynx. Ces mouvements subtils sont souvent le seul mouvement observé chez les animaux très anciens.
4. Retour des plaques dans l'incubateur à 20 ° C
5. Répétez l'étape 2-4 tous les deux à trois jours jusqu'à ce que tous les animaux sont morts.

4. Des résultats représentatifs.

Cette section montre un exemple de la façon de tenir des registres de la durée de vie des données générées par cet essai et quelques résultats représentatifs.

La figure 1A montre un exemple de la façon d'enregistrer des données pendant la durée de vie dans ce test. Une feuille Excel est utilisé pour garder la trace de la survie des populations dans chaque puits. Pour chaque bien c'est de coordonner dans la plaque, la souche, la drogue, la concentration de la drogue et le nombre total d'animaux vivants au jour 0 (X0) est enregistré au début de l'expérience. Noter la date, ainsi que le nombre d'animaux morts vivants et trois fois par semaine afin de suivre la survie des populations différentes dans chaque puits. Pour représenter graphiquement les résultats, calculer la fraction des animaux vivants pour chaque jour et il intrigue comme une fonction du temps en jours. P-valeurs doivent être calculées en utilisant les logiciels statistiques, comme STATA ou logiciels similaires.

La durée de vie moyenne C.elegans dépend de la température. Figure 1B montre que les changements de température dépend de la durée de vie sont fidèlement reproduites par le dosage de la durée de vie basée microtitration ^22. De même, le dosage de plaque de microtitrage reproduit des changements dans la durée de vie des mutants auraient une espérance de vie qui diffèrent de type N2 animaux sauvages ^{23-24 25} (figure 1C).

Le test peut également être utilisé pour faire des déclarations plus quantitative. Dans signifie Fig1D durée de vie est tracée en fonction de la concentration mirtazépine ^7. Chaque point de données représente la durée de vie moyenne de 7-12 population, chaque séjour dans un autre bien. Même si le nombre d'animaux par puits est relativement faible (5-15 animaux), la variation du bien-au-puits est relativement faible comme on peut le voir les barres d'erreur.

Figure 1. La microplaque basée durée d'essai reproduit fidèlement les changements dans la durée de vie rapportés dans la littérature.
(A) Exemple de données recueillies dans une feuille de calcul Excel. Lors de chaque date de la séance de comptage, de coordonner du puits et le nombre d'animaux vivants et des morts a été enregistré. Au début de l'expérience, le nombre total d'animaux dans chaque puits a été déterminée. (B) la courbe de survie de type sauvage (N2) animaux élevés à 20 ° C et 25 ° C. Les courbes de survie (C) des souches porteuses de mutations qui affectent la durée de vie. Tous les quatre souches ont été dosés en parallèle à 20 ° C. (D) de la courbe dose-réponse mirtazépine animaux traités N2. Durée de vie moyenne est tracée en fonction de la concentration mirtazépine. Les barres d'erreur indiquent la SEM de 8 puits par condition.

5. Matériaux.

M9 tampon, 1000 ml

• 6 g de Na ₂ HPO ₄
• 3 g de KH ₂ PO ₄
• 5 g de NaCl
• 0,25 g MgSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• Ajouter de l'eau déminéralisée à 1000 ml
• Autoclave

Tampon pH 6,0 Potassiumphosphate, 1000 ml

• 136 g de KH ₂ PO ₄
• Ajouter de l'eau déminéralisée à 900 ml
• Ajuster le pH à 6,0 avec KOH 5M
• Ajouter de l'eau déminéralisée à 1000 ml
• Autoclave

Solution métallique Trace

• 1,86 g de Na ₂ EDTA
• 0,69 g FeSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 0,20 g _MnCl2 ∙ 4H ₂ O
• 0,29 g de ZnSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 0,016 g de CuSO ₄
• 1000 ml d'eau déminéralisée
• Autoclave et conserver dans l'obscurité.

S-basale moyenne, 1000 ml

• 5,9 g de NaCl
• 50 ml de phosphate de potassium 1M, pH 6,0
• 1000 ml d'eau déminéralisée
• Autoclave
• Laisser la solution refroidir et ajouter 1 ml de cholestérol 5mg / ml (dissous dans Et-OH).

Le citrate de potassium 1M, 1000 ml

• 268,8 g de citrate tripotassique
• 26,3 acide citrique monohydraté
• Ajouter 900 ml d'eau déminéralisée
• Ajuster le pH à 6,0 avec KOH 5M
• Ajouter de l'eau déminéralisée à 1000 ml
• Autoclave

S-milieu complet, 1000 ml

• 977 ml de S-basale
• 10 ml de citrate de potassium 1M pH 6 (stérile)
• 10 ml Trace métaux solution (stérile)
• 3 ml de CaCl ₂ 1M (stérile)
• 3 ml 1M MgSO ₄ (stérile)

Agar NGM

• 3.0g de NaCl
• 2.5g Pepton(À partir de caséine, du pancréas digèrent)
• Agar 17g
• Ajouter de l'eau déminéralisée à 975 mL et une barre d'agitation
• Autoclave
• Après autoclavage refroidir à 55 ° C et ajouter les éléments suivants:
  • 0,5 ml de CaCl ₂ 1M (stérile)
  • 1 ml de cholestérol 5mg / ml dans l'éthanol
  • 1 ml de 1M MgSO ₄ (stérile)
  • 25 ml de tampon Potassiumphosphate, pH 6,0 (stérile)

La tuberculose, 1000 ml

• 12g Bacto Tryptone
• 24 g Extrait de levure
• 4 ml de glycérol
• Ajouter 900 ml d'eau déminéralisée
• Autoclave
• Après autoclavage refroidir à 55 ° C et ajouter les composants suivants:
  • Ajouter 100 ml de 0,17 M de KH ₂ PO ₄ / 0.72MK ₂ HPO ₄

0,6 mM fluorodésoxyuridine (FUDR, sigma # cat F0503), 1000 ml

• 100 mg FUDR
• Dissoudre dans 670 ml stériles S-complet, faire 10 ml ou 45 ml aliquotes.
• Conserver à -20 ° C.

100 mg / ml de carbénicilline, 10 ml

• 1 g carbénicilline
• 10 ml d'eau stérile déionisée
• Filtrat stérile et aliquot
• Conserver à -20 ° C.
• Utiliser à une concentration finale de 50 pg / mL

250ug / ml d'amphotéricine B, 4 ml

• 1mg amphotéricine B
• 4 ml et-OH
• Conserver à -20 ° C
• Utiliser à une concentration finale de 0,1 pg / ml

Discussion

Le protocole présenté permet la mesure de la durée de vie dans C.elegans 96 plaques de microtitration bien. Comme le montre le représentant de la section des résultats il réplique de manière fiable les résultats précédents et fournit des informations quantitatives. L'utilisation de ce test, nous avons examiné plus de 89000 avec succès des molécules pour leur effet sur ​​la durée de vie C.elegans.

Aux fins de dépistage de drogue, la mesure de la durée de vie dans un format 96 plaques de microtitration ainsi a plusieurs avantages sur le dosage classique des milieux solides. Elle réduit le travail nécessaire pour les médias de préparation, la quantité d'espace d'incubation, et la quantité de médicament nécessaire. Le format de 96 puits et l'installation de microscopie permettant l'automatisation du test de l'ensemble des projections à haut débit.

Pendant le développement de l'analyse de plusieurs valeurs pour chaque variable et leurs combinaisons ont été testées pour leurs effets sur la durée de vie C.elegans. Ces tests incluaient différentes concentrations OP50 allant de 3 à 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), le nombre de vers par puits allant de 7 à 45 (7, 10, 15, 22, 45 ver / puits), les volumes de culture différente allant de 40 à 150 ul par puits (40, 60, 80, 100, 120, 150 pi), et des changements dans la composition du tampon. S'ils sont nourris avec un OP50 résistantes à la carbénicilline, ni carbénicilline, ni l'amphotéricine B dans les concentrations indiquées ont été trouvés à affecter C.elegans durée de vie. Continue agitation douce des plaques, comme c'est souvent recommandé dans C.elegans culture liquide, a été retrouvé dispensable pour les petits volumes utilisés dans ce dosage. Agitation douce est cependant nécessaire si les plaques de microtitration avec plus de puits doivent être utilisés. Les valeurs indiquées dans ce protocole ont été soigneusement choisis en fonction de la comparaison statistique des différentes conditions testées.

La caractéristique la plus surprenante de ce dosage est probablement le fait que C. elegans peut être conservé dans des plaques 96 puits qui sont scellées avec du ruban adhésif. Side-by-side comparaisons n'a révélé aucune différence dans la durée de vie des animaux d'élevage dans les plaques non scellées, dans des assiettes scellé avec un scellant en plastique, ou en plaques scellées avec les chasseurs qui permettent l'échange d'air. Dans les trois conditions, les animaux ont développé très homogène de L1 à des adultes gravides dans les 65 heures et a montré une durée de vie très comparable. Animaux cultivées en parallèle sur NGM développée un peu plus vite, mais cette différence était indépendante de l'absence ou la présence d'un scellant.

Le protocole présenté est basé sur des bactéries vivantes, mais peut être adapté pour les bactéries mortes. Toutefois, dans un dosage de liquide, une seule bactérie survivant peut se multiplier rapidement et de repeupler la culture. Dans nos mains, le seul moyen fiable pour tuer les bactéries dans la mesure où ils peuvent être utilisés pour la culture liquide est par un traitement prolongé de la bactérie à l'irradiation gamma.

Un point important à considérer dans la planification d'une expérience de vie est la puissance de détection. Dépendant de la taille de l'effet, l'effet de la drogue d'intérêt doivent être testés dans plusieurs puits. Dans un essai typique 4 traités par le médicament et 4 puits de contrôle, correspondant approximativement à 40-50 animaux chacun, devrait suffire pour détecter une augmentation de 30% la durée de vie dans plus de 95% des expériences. Augmente de 14% ne sont détectés dans 60% des cas et nécessitent donc plus de puits répliquer.

La richesse des données générées par la durée de vie ce test peut être utilisé pour développer des expériences ou des modèles de Gompertz souche spécifique paramétrique ^1. Ces modèles de Gompertz sont utiles pour déterminer la puissance de détection et d'estimer le nombre de faux positifs et négatifs pour les grands écrans. Nous avons vérifié les prédictions de ces modèles dans des expériences aveugles et les ont utilisés pour estimer le nombre de faux négatifs dans les écrans de grande taille (résultats non publiés).

En résumé, nous prévoyons que le test sera présenté d'une grande utilité pour identifier des petites molécules qui prolongent la durée de vie de C.elegans et d'étudier les mécanismes sous-jacents.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Calbiochem	cat# 171375	Also called Fungizone
FUDR	Sigma-Aldrich	cat# F0503	FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin	Sigma-Aldrich	M2525-250MG	Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine	Sigma-Aldrich	cat#C6022-MG	Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape	Nalge Nunc international	cat# 236370	Polyester, non-sterile
96 well plate	Falcon BD	cat# 351172	Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask	Nalge Nunc international	cat# 178883	used for large volumes