Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence

Résumé

Comportement des dosages pour mesurer des fonctions locomotrices, l'apprentissage et les capacités de mémoire Drosophile.

Résumé

Les progrès dans les méthodes génétiques ont permis l'étude de gènes impliqués dans des maladies neurodégénératives humaines en utilisant la drosophile comme système modèle ^1. La plupart de ces maladies, y compris la maladie d'Alzheimer, de Parkinson et la maladie de Huntington sont caractérisées par l'âge-dépendant détérioration des fonctions d'apprentissage et de mémoire et ² la coordination des mouvements. Ici, nous utilisons des tests de comportement, y compris le dosage géotaxie négative ³ et le dosage aversifs de suppression phototaxic (APS test) ^4,5, pour montrer que certaines des caractéristiques de comportement liés à une neurodégénérescence humaine peut être récapitulée dans mouches. Dans le dosage géotaxie négative, la tendance naturelle des mouches de se déplacer contre la gravité lorsqu'il est agité est utilisé pour étudier les gènes ou les conditions qui peuvent entraver les capacités locomotrices. Dans le dosage de l'APS, les fonctions d'apprentissage et de mémoire sont testés dans positivement phototactiques mouches formés à associer la lumière avec aversifs goût amer et donc éviter cette tendance naturelle de se déplacer autrement, vers la lumière. Tester ces mouches formé 6 heures post-formation est utilisée pour évaluer les fonctions de mémoire. L'utilisation de ces tests, la contribution de tous les facteurs génétiques ou environnementaux vers la neurodégénérescence développement peuvent être facilement étudiées chez les mouches.

Protocole

1. Présentation

Dans cette vidéo, nous allons démontrer deux tests comportementaux en utilisant la drosophile afin de démontrer la mesure de la locomotion et les fonctions d'apprentissage et de mémoire qui sont compromis dans les troubles neurodégénératifs. Tout d'abord, nous allons montrer comment le comportement locomoteur peut être mesurée en utilisant le dosage géotaxie négative. Deuxièmement, nous allons évaluer les capacités d'apprentissage et de mémoire en utilisant des mouches positivement phototactiques qui sont formés pour associer la lumière avec un goût amer et aversifs ensuite testé 6 heures plus tard pour évaluer les fonctions de mémoire. Enfin, nous allons discuter les implications et les limites de ces tests de comportement.

2. Équipements et de réactifs

1. Fly travaux
   • Champ stéréo (Zeiss)
   • Petits pinceaux pour pousser mouches
   • Drosophile dioxyde de carbone (CO ₂₎ les appareils d'anesthésie (Geneseesci, Inc)
2. Assay géotaxie négative
   • 28,5 x 95 mm de polystyrène Vial (Capitol Vial, Inc)
   • Mini-alarme Minuteur / Chronomètre (VWR International)
   • Stylos Sharpie
   • Ruban adhésif
3. Assay aversives répression phototaxie
   • Chlorhydrate de quinine (Sigma Aldrich, numéro du CAS: 6119-47-7)
   • Eau distillée
   • Numérique échelle de mesure pour la dilution précise en poids
   • Connecteurs rapide Débranchez, polyéthylène haute densité (NALGENE VWR Catalog No. 62868-021)
   • Tube de 15 ml à centrifuger (VWR International), coupé à la marque de 2 ml d'extrémité fermée pour s'adapter à l'adaptateur Débrancher le connecteur rapide pour source de lumière
   • Monocanal 200 uL pipetteur pour charger solution de quinine sur un papier filtre tapissant la chambre de
   • T-Maze (Simple systèmes comportementaux; Figure 1)
   • Aluminium Foil
   • Source de lumière (Zeiss)
   • Une lampe avec une lumière rouge.
   • Papier filtre
   • Mini-alarme Minuteur / Chronomètre (VWR International)

3. Préparation des Mouches

• Les mouches sont maintenues sur la norme de farine de maïs-agar-mélasse-levure à 25 ° C sur une période de 12 h cycle lumière / obscurité.
• Virgin vole sont isolés sous anesthésie dioxyde de carbone sur le jour de l'éclosion. Pour les études de vieillissement, les mouches sont maintenus dans des groupes de vingt par flacon et transféré dans un flacon frais tous les 3 jours. Il est important d'utiliser des mouches fratrie du même croisement des parents pour les études de vieillissement, de minimiser les différences résultant de fonds génétiques.
• Pour les deux essais, les mouches sont sexuées et maintenus en groupes de dix mouches par flacon. La différence entre les sexes sur le comportement est significatif et il est conseillé de ne pas mélanger les mouches mâles et femelles dans une étude que les données peuvent être difficiles à interpréter et à reproduire ^6.
• Pour le dosage géotaxie négative, les mouches sont triés en groupes de dix par flacon et testé une heure après l'anesthésie. Il est important pour les mouches se remettre complètement de l'anesthésie, car cela pourrait avoir un effet sur les activités de locomotion.
• Pour le dosage APS, les mouches de chaque groupe sont placés dans un flacon en polystyrène vides avec de l'eau du papier filtre imbibé pendant six heures avant le dosage est effectué. Cela garantit que les mouches sont affamés avant le dosage et sera plus perspicace au goût aversif. Juste avant le dosage est effectué, chaque volée à partir d'un groupe de dix est placé dans un tube à centrifuger de 15 ml vide, qui est alors plafonnée lâchement, pour éviter de s'échapper.

4. Assay géotaxie négative

• Géotaxie est généralement mesurée pendant dix à vingt groupes de dix individus de même génotype ou de traitement (100-200 mouches total pour chaque génotype / traitement) ^7. Trier des groupes de dix mouches féminine ou masculine sur un appareil d'anesthésie CO ₂ et le lieu de chaque groupe dans un flacon séparé. Prévoyez au moins une heure pour les mouches pour se remettre de l'anesthésie.
• Préparez l'appareil d'escalade pour chaque groupe, de telle sorte que deux flacons vides en polystyrène sont verticalement rejoint par la bande en face de l'autre. Il est important de s'assurer que les ouvertures des flacons sont parfaitement alignés les uns avec les autres pour offrir une surface plane d'escalade pour les mouches.
• Pour le bas du flacon, de mesurer une distance verticale de 8 cm au-dessus de la surface du fond et de marquer chaque flacon en traçant un cercle autour de la circonférence de la fiole.
• Transfert d'un groupe de dix mouches dans le bas du flacon soigneusement pour empêcher la fuite de toute volée. Recouvrir immédiatement le bas flacon avec le flacon de bandes en haut et en toute sécurité à proximité des ouvertures de contact. Autoriser les mouches de s'acclimater à la nouvelle configuration pendant 1 minute avant d'effectuer le dosage.
• Tapoter doucement la vole vers le bas du flacon et de mesurer le nombre de mouches qui peuvent grimper dessus de la barre de 8 cm par 10 secondes après le robinet.
• Répétez ce test pour le même groupe de dix fois, permettant une période de repos entre chaque minute d'essai.
• Notez le nombre de mouches par groupe qui a franchi la barre de 8 cm comme unpourcentage de mouches total.

5. Assay aversives répression phototaxie (APS Assay)

Originaire adapté du Bourg et Buecher (2002) ^4, ce test exploite le comportement positif dans phototactiques mouches pour les former à associer la lumière avec des stimuli aversifs (dans ce cas, le goût amer de la quinine). Après une phase de formation / le conditionnement, les mouches de type sauvage sera capable d'associer la zone éclairée avec goût aversif et l'éviter. Les mouches avec des capacités d'apprentissage compromis ne parviendra pas à faire de cette association. Par ailleurs, le dosage APS peuvent également être utilisés pour mesurer la fonction de mémoire courte durée de mouches ⁵ en soumettant déjà mouches formés pour le même test de conditionnement 6 heures après pour tester leur capacité à se souvenir des tâches apprises.

1. Préparation de la solution de quinine
   • Dissoudre le chlorhydrate de quinine dans l'eau distillée pour obtenir une solution stock de 0,1 M (1.98g dans 50 ml d'eau distillée). La solution stock peut être conservé à -20 ° C jusqu'à un an dans de petites aliquotes
   • Préparer une solution de travail de 1 uM en diluant la solution stock dans de l'eau distillée.
2. Préparation de la T-Maze
   • Labyrinthe en T se compose de la colonne du centre avec la trappe et deux chambres indépendantes, une "sombre" de chambre et un "allumé" chambre (figure 1).
   • Préparation de la Chambre: prendre deux tubes à centrifuger de 15 ml en plastique et couper à 2 mL de la marque en bas à bout fermé avec une scie manuelle. Monter les adaptateurs à chaque extrémité, et scelle le lien avec du parafilm. L'adaptateur à l'extrémité du tube sert la fente d'entrée pour la source de lumière à col de cygne. Connectez un tube avec la source de lumière et de ce tube sera le "éclairés" de chambre. Enveloppez l'autre tube de papier d'aluminium pour servir de "sombre" de chambre.
   • Ajouter 180uL soit de l'eau distillée ou une solution de quinine à filtre en papier et les placer dans la chambre de lumière.
   • Assemblez le labyrinthe en T, par vissage des chambres lumineuses et sombres de chaque côté de la colonne du centre, avec la trappe dans le milieu fermé (figure 1).
   • Insérez la source de lumière dans la chambre éclairée.
3. Formation des mouches pour supprimer phototaxie avec des stimuli aversifs
   • Dévissez la chambre noire du labyrinthe en T et de transférer une seule mouche dans cette chambre et immédiatement visser le tube noir vers le labyrinthe.
   • Éteignez les lumières dans la pièce et allumer la lampe rouge.
   • Autoriser la volée de s'acclimater dans la chambre noire pendant 30 secondes et tourner lentement sur la source lumineuse éclairant la chambre éclairée. Lentement ouvrir la trappe qui sépare les deux chambres.
   • Si la mouche se dirige vers la chambre allumée pendant 10 secondes, il est considéré positivement phototactiques et est prêt à être formés pour le dosage. Le défaut de phototaxie indique des problèmes dans le système visuel et les mouches avec du phototaxie négatives doivent être exclus de l'analyse.
   • Pour aversives répression phototaxie (APS) de formation, appuyez sur la mouche qui a démontré phototaxie positifs à la chambre noire, près de la trappe et éteignez la lumière. Attendre 30 secondes d'acclimatation. Pendant ce temps, placez le papier filtre avec une solution de quinine dans la chambre éclairée. Lentement ouvrir la trappe et allumez la lumière. Autoriser la marche voler dans la chambre éclairée la quinine couché. Après une minute, appuyez sur le vol de retour à la chambre noire et répétez cette 9 fois plus. (En général, éviter les mouches de type sauvage de la chambre allumée après 3 à 5 essais de formation.)
   • Immédiatement après la formation, cinq essais de test sera effectué. Dans chaque essai essai, attendez 10 secondes après la lumière est allumée pour la mouche entraînés à marcher dans la chambre éclairée. Le défaut de marcher sur le flacon allumée sera enregistré comme «Pass», qui est équivalent à «tâche appris par renforcement». Le taux de réussite au cours des cinq essais consécutifs est enregistré et montré dans la figure 2 ci-dessous que PC0 (0 conditionné après h).
4. Évaluation de la fonction mémoire à court terme chez des mouches
   • Après une formation initiale et PC0 enregistrements, chaque mouche est replacé dans son flacon d'origine et l'alimentation tenu à l'écart pendant six heures.
   • Six heures après la formation, sous réserve de chaque mouche à 5 essais à nouveau de la même manière que précédemment, et d'enregistrer le nombre de fois à la volée évite (passe) ou va dans (échec) le flacon éclairée. Ce taux de réussite est enregistré comme PC6 (6 heures après le conditionnement), qui est un indicateur de la mémoire à court terme.

6. Interprétation et analyse des données statistiques

1. Assay géotaxie négative
   • Les données brutes générées par ce test représente le nombre de mouches traversant la marque de 8 cm en 10 secondes dans chaque groupe. Convertis cette proportion et de calculer le taux de réussite moyen pour chaque groupe de plus de 10 séances.
   • Les données sont représentées graphiquement comme un taux de réussite moyen par groupe (génotype, traitement, etc) avec l'erreur-type de la moyenne (SEM).
   • Différences entre les groupespeut alors être déterminée pour être statistiquement significatif ou non en utilisant un test t de Student ou l'ANOVA.
2. Assay aversives répression phototaxie
   • Les données brutes de ce test est représenté comme le nombre de fois chaque mouche évite la chambre allumée dans cinq essais successifs. Le taux de réussite est calculé comme le pourcentage d'essais d'évitement succès au cours des essais au total. Calculer le taux de réussite moyen de cette manière pendant un minimum de 15 mouches par groupe.
   • Les données sont représentées graphiquement comme taux de réussite moyen PC0 (immédiatement après le conditionnement; «apprentissage» d'indicateur) ou taux de réussite moyen PC6 (6 heures après conditionnement; «mémoire» témoin) avec MEB respectif.
   • Indices d'apprentissage et la mémoire sont comparés entre les groupes à la fois avec le type sauvage et «génétiquement manipulé-bénigne" du groupe (tels que la GFP surexprimant d'oiseau) de manière appropriée.

7. Les résultats représentatifs

Dans cette expérience, la vidéo, nous évaluons les déficits d'apprentissage et la mémoire et le moteur de mouches surexprimant Tau humaines dans le système nerveux central et en comparant leurs performances à celles des mouches surexprimant GFP. Surexpression de Tau neuronales humaines chez la drosophile a été montré pour causer de graves vacuolisation dans le cerveau ⁸ et conduire à des déficits importants dans l'apprentissage et des fonctions de mémoire ^9. Comme le montre la figure 2A, 10 jours vieux mâle ou femelle vole surexprimant humaine Tau ont des déficits locomoteurs significative par rapport à appariés selon l'âge surexprimant GFP mouches. En outre, ces mouches échoué à associer la lumière avec un goût amer comme le montrent les taux de réussite par rapport PC0 au groupe de contrôle, ainsi que ne pas se rappeler de cette association, comme indiqué par une baisse des taux de réussite PC6 (figure 2B). Cette expérience confirme en outre que les modèles drosophiles peuvent être utilisées pour étudier les humains des maladies neurodégénératives et récapitulant certains des phénotypes comportementaux observés chez les humains et les mammifères.

Figure 1. T-Maze Configuration pour Assay aversives répression phototaxie. A. La configuration globale expérimentale pour l'expérience APSA avec la source lumineuse reliée au "éclairés" tube falcon, de papier-filtre et le "sombre" du tube sur la gauche (couvert en fleuret), séparés par une trappe. B. Pendant la phase d'entraînement et d'essai, la mouche est dans la chambre noire et la trappe s'est ouverte après la lumière est allumée dans la chambre éclairée.

Figure 2. Les résultats représentatifs de la géotaxie négative et d'expérimenter l'APS en utilisant des mouches surexprimant GFP ou Tau avec un pilote pan-neuronale. A. Dans le dosage géotaxie négative, 10 jours anciens de sexe masculin (colonne bleue) ou femelle (colonne rouge) vole surexprimant GFP a montré une plus grande activité d'escalade que de Tau-surexprimant mouches. B. de 20 jours féminine ancienne mouches surexprimant GFP a montré un meilleur apprentissage (PC0) et mémoire (PC6) de fonctions que Tau surexprimant mouches.

Discussion

Les deux géotaxie négatifs et des dosages de l'APS sont robustes tests comportementaux pour mesurer l'évolution de locomotion ou d'apprentissage et les capacités de mémoire résultant de manipulations génétiques ou environnementaux. Cependant, il ya quelques inconvénients à ces épreuves qui attendent une optimisation plus poussée.

En test géotaxie négative, des mutations dans certains gènes peuvent rendre dysfonctionnements moteurs sévères chez les mouches. Dans de tels cas, les mouches peuvent difficilement escalader les murs en réponse à la gravité sur l'agitation. Autre comportement des dosages qui mesurent directement le mouvement peut être plus approprié. Ces tests comprennent comportement réflexe de redressement que les mesures de la paralysie et la saisie de ^10, et le comportement optomoteur ¹¹ qui enregistre une perte de coordination des mouvements.

En test APS, le premier obstacle peut être vole au hasard s'arrêter à l'entrée de la chambre allumée sans avancer. Cela devient plus problématique si le vieillissement est l'une des conditions étudiées, puisque plus des mouches sont moins actifs en général et ont tendance à s'arrêter et se reposer pendant de longues périodes de temps. Dans ce cas, l'expérimentateur doit fournir des stimuli mécaniques pour promouvoir le mouvement, qui n'est pas toujours efficace. Deuxièmement, on pourrait soutenir que l'échec pour aller à la chambre de résultats éclairée par une perte de phototaxie positif. Ce qui est rarement le cas, puisque les travaux antérieurs ont montré que les mouches retourner à la lumière une fois la réactivité négative est enlevée renforcent ^4. Troisièmement, la durée de contact avec le stimulus aversif peuvent varier d'un essai à. Cette variation peut généralement être réduite en encerclant la paroi intérieure de la chambre avec un papier filtre imprégné d'empêcher les mouches de se soustraire à la quinine. En outre, l'expérimentateur peut garantir que chaque volée passer assez de temps en contact avec le papier filtre en augmentant la quantité de temps passé dans la chambre de l'indication contraire 1 minute.

En résumé, géotaxie négatifs et des dosages de l'APS sont des moyens simples et rapides d'évaluation des déficits comportementaux et quantitativement indiquent locomoteur et de l'apprentissage et les capacités de mémoire chez la drosophile. Ces tests sont particulièrement utiles dans la modélisation des maladies neurodégénératives humaines chez la drosophile.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériaux	Société	Nombre de catalogue	Commentaire
Flacon en polystyrène	Vial Capitole, Inc	28Fly	28,5 x 95 mm de polystyrène Vial, la qualité des documents importants, mauvaise si elle est trop glissante pour les mouches de grimper.
Dissection Stéréoscope	Zeiss	000000-1432-979	2 Guide des branches de lumière en col de cygne (12V/30W)
Chlorhydrate de quinine	Sigma-Aldrich	6119-47-7	Dissoudre dans l'eau distillée.
Connecteurs rapide Débranchez	Nalgene (VWR)	62868-021	Polyéthylène haute densité
T-Maze	Simple systèmes comportementaux
Monocanal 200 pipettes uL	Eppendorf	022443305