Expansion, purification et d'évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d'évaluer leur fonction.

Résumé

Natural killer (NK) jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire contre une variété de microorganismes infectieux et les tumeurs. La disponibilité limitée des cellules NK et capacité à développer in vitro, a restreint le développement de l'immunothérapie des cellules NK. Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement de grandes quantités de cellules in vivo NK fonctionnelles ex K562 en utilisant des cellules exprimant membranaires IL21, comme une artificielle cellule présentatrice d'antigène (VAMP).

Thérapies des cellules NK adoptive à ce jour ont utilisé un produit cellulaire obtenu par l'état stationnaire leucophérèse du donateur suivie par la déplétion des cellules T ou de la sélection positive des cellules NK. Le produit est généralement activé dans IL-2 pendant la nuit et ensuite administré le lendemain ^1. En raison de la faible fréquence de cellules NK dans le sang périphérique, un nombre relativement restreint de cellules NK ont été livrés dans les essais cliniques.

L'incapacité à se propager dans les cellules NK in vitro a été le facteur limitant pour générer des nombres de cellules suffisant pour les résultats cliniques optimaux. Certains d'expansion des cellules NK (5-10 fois plus 1-2 semaines) a être atteint par de fortes doses d'IL-2 seul ^2. L'activation des cellules T autologues peuvent arbitrer l'expansion des cellules NK, probablement aussi par la libération de cytokine local ^3. Soutien à stroma mésenchymateux ou des cellules antigènes artificiels présentant (VAMP) peut soutenir l'expansion des cellules NK à la fois du sang périphérique et le sang du cordon ^4. Combiné NKp46 et l'activation par des anticorps CD2 billes recouvertes soit actuellement commercialisé pour l'expansion des cellules NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), entraînant une dilatation environ 100 fois en 21 jours.

Des essais cliniques utilisant VAMP-expansé ou activées par les cellules NK sont en cours, l'un utilisant la lignée cellulaire leucémique CTV-1 aux cellules NK et d'activer le Premier ⁵ sans expansion significative. Un deuxième essai utilise EBV LCL pour l'expansion des cellules NK, la réalisation d'une expansion dire 490 fois en 21 jours ^6. La troisième utilise une VAMP K562 basé transduites avec 4-1BBL (CD137L) et membranaires de l'IL-15 (mIL-15) ^7, qui a réalisé une expansion signifie NK 277 fois en 21 jours. Bien que, les cellules NK étendu en utilisant K562-41BBL-mIL15 VAMP sont hautement cytotoxique in vitro et in vivo par rapport aux non expansées cellules NK, et de participer à l'ADCC, leur prolifération est limitée par la sénescence attribués à ⁸ raccourcissement des télomères. Plus récemment une expansion de 350 fois des cellules NK a été rapportée en utilisant K562 exprimant MICA, 4-1BBL et IL15 ^9.

Notre méthode de l'expansion des cellules NK décrits aux présentes produit prolifération rapide de cellules NK, sans atteindre la sénescence une expansion médiane 21 000 fois en 21 jours.

Protocole

1. Isolation des PBMC de Buffy Coat

Cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont obtenues par centrifugation sur la densité de flottaison Ficoll-Paque d'échantillons de donneurs sains couche leuco-dérivé par cytaphérèse.

1. La centrifugation Ficoll-Paque est faite selon le protocole du fabricant avec des modifications mineures.
2. Ajouter PBS pour un donneur normal-banque de sang buffy coat à un volume final de 140 ml (typique du volume buffy coat est de 40-70 ml).
3. Couche 35 ml d'échantillon sur la couche leuco-15 ml de Ficoll-Paque (4 tubes).
4. Centrifuger à 400g pendant 20 minutes sans frein.
5. Récupérer les PBMC du Ficoll-Paque: interface plasma, ne jetez pas les globules rouges au bas de l'Ficoll-Paque.
6. Lavez PBMC trois fois avec PBS, centrifugation à chaque fois à 400g pendant 10 minutes.
7. PBMC peuvent être utilisés directement pour l'expansion des cellules NK à ce stade ou les cellules NK peuvent être isolées par RosetteSep (section 4)
8. PBMC restantes peuvent être congelés dans FBS contenant 10% de DMSO dans l'azote liquide.
9. Aspirer le Ficoll et de recueillir les globules rouges de l'étape 5 en deux 50 ml tube de centrifugeuse, laver trois fois avec du PBS (ajouté à 50 ml marque), chaque fois aspirer le surnageant écrémage au sommet de la couche de RBC pour enlever les granulocytes.
10. Les globules rouges peuvent être utilisées immédiatement pour RosetteSep  purification des cellules NK (se référer à la section 4) ou stockées dans un volume égal de solution d'Alsever à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (Les globules rouges peuvent être enregistrer pour un maximum de 4 semaines).

2. L'expansion des cellules NK

L'expansion des cellules NK peuvent être initiées en utilisant PBMC ou cellules NK purifiées. Le montant des PBMC utilisé pour l'expansion peut être modifiée en fonction de la quantité de cellules NK souhaité à la fin d'une expansion de trois semaines, se référer à des résultats représentatifs pour les détails. (Voir Note 1)

STIMULATION 1

Jour 0

1. Pour chaque ⁶ 5x10 PBMC d'être élargi, de comptage et d'irradier 10x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy.
2. Post-irradiation, laver les cellules avec du PBS et remettre en suspension dans l'expansion des cellules NK médias (Nkem).
3. Graine 5x10 ⁶ PBMC par 10x10 ⁶ irradiés K562 CL9 mIL21 (1:2) dans 40 ml de Nkem dans un flacon T75 et le placer en position verticale dans une étuve à 37 ° C et CO ₂ 5%.

Jours 3 et 5

4. Récupérer les cellules par centrifugation à 400g pendant 5 minutes et remplacer la moitié des médias avec Nkem frais (ajouter IL2 frais pour l'ensemble du volume des médias) et continuer la culture.

STIMULATION 2

Jour 7

1. Comptez le nombre de cellules en culture, à la fin d'une semaine.
2. Mettez de côté 5x10 ⁵ cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2)
3. Pour chaque ⁶ 5x10 cellules pour être restimulées, compter et irradient 5x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy.
4. Ajouter un nombre égal de irradié K562 CL9 mIL21 (1:1) et remettre en suspension dans Nkem au 2.5x10 ⁵ cellules totales / ml (voir note 3).
5. Semences dans les cellules flacons T75 (maximum 50 ml par flacon).

Jours 10 et 12

6. Comptez le nombre de cellules.
7. Changer ensemble des médias avec les Nkem frais basé sur le nombre de cellules (voir note 3).

Jour 14

8. A la fin de deux semaines de l'expansion de compter le nombre de cellules en culture.
9. Mettez de côté 5x10 ⁵ cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2)
10. Si l'expansion a commencé à partir de PBMC les cellules NK peuvent être purifiées à ce stade de l'expansion en utilisant le protocole de purification RosetteSep (se référer à la section IV). Si l'expansion a commencé à partir de cellules NK purifiées procéder à une stimulation 3.
11. Après purification mis de côté 5x10 ⁵ cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux pour vérifier la pureté des cellules NK (comme dans l'étape 8).
12. Procéder à la stimulation 3 en utilisant l'ensemble des cellules NK purifiées (voir note 4).

STIMULATION 3

1. Resuspendre les cellules NK avec irradiés K562 CL9 mIL21 (1:1) dans Nkem basée sur le nombre de cellules (voir note 3).

Jours 17 et 19

2. Comptez le nombre de cellules.
3. Changer médias avec Nkem frais se basant sur le nombre de cellules (voir note 3).

Jour 21

4. Au bout de trois semaines de l'expansion de compter le nombre de cellules en culture.
5. Récupérer 1x10 ⁶ cellules pour une analyse de cytométrie en flux pour le panneau de cellules NK pleine d'anticorps phénotypage (voir tableau 1).
6. Gel dans les cellules SVF contenant du DMSO 10% à une densité maximum de 5x10 ⁷ cellules par flacon pour une utilisation future.

3. Assay NK cytotoxicité cellulaire

1. Décongelez un flacon de cellules NK et les semences dans Nkem, un jour avant performing test de cytotoxicité pour permettre la récupération.
2. Pour chaque test de cytotoxicité des cellules NK en utilisant une ligne seule cible cellulaire, 6x10 ⁵ cellules NK et 3x10 ⁵ cellules cibles sont nécessaires (voir note 5).
3. Préparer CAM-Media en diluant calcéine-AM (stock 1 mg / ml dans le DMSO) dans Nkem (voir note 6).
4. Resuspendre 10 ⁶ cellules cibles dans 1 ml de CAM-médias (voir note 7).
5. Incuber pendant 1 h à 37 ° C, avec agitation occasionnelle.
6. Resuspendre les cellules NK au 1x10 ⁶ cellules / ml et ajouter 200uL de suspension de cellules NK à chacun des 3 puits d'un U-96 puits à fond plat à 10 correspondants: 1 rapport E: T de la figure 1. (Voir note 8)
7. Ajouter 100 ul de milieu complet à tous les puits restants à l'exception des "maximum".
8. Ajouter 100 ul de 2% de Triton X-100 à "maximum".
9. Effectuer des dilutions en série des cellules NK pour le E 5 ultérieurs: les ratios T en transférant 100 ul de cellules à chaque fois, bien mélanger. Jeter 100ul du dernier puits (rapport E: T de 0.3125:1).
10. Après 1 heure de chargement calcéine, laver les cellules cibles dans Nkem deux fois, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. (Voir note 9)
11. Re-compter les cellules cibles et remettre à 1x10 ⁵ cellules / ml.
12. Ajouter 100 ul de cellules cibles dans chaque puits (1x10 ⁴ / puits). Centrifuger 1 min à 100g à initier un contact cellulaire.
13. Incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 4 heures.
14. Mélanger délicatement la culture par pipetage avec un pipetteur 100 pL afin d'uniforme suspendre la calcéine libérée, ralentit plaque à 100g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et transférer 100 ul du surnageant d'une nouvelle plaque en prenant soin d'éviter les bulles. Pop les bulles qui peuvent se former en utilisant une aiguille fine.
15. Lire la plaque à l'aide d'un lecteur de plaque fluorescente (filtre d'excitation 485 nm, filtre d'émission 530 nm). Lire Bas est recommandée.
16. Calculer pourcentage de lyse spécifique en fonction de la formule [(version version-test de spontanée) / (libération maximale - libération spontanée)] x 100.

4. Purification des cellules NK par RosetteSep

1. Prenez 100 fois plus de globules rouges à celui des PBMC ou des cellules élargi, dans un tube de 50 ml (100:1 RBC: PBMC).
2. Si vous utilisez les globules rouges fraîches procéder directement à l'étape suivante ou si les globules rouges ont été entreposés dans une solution d'Alsever s, compter le nombre de globules rouges et de lavage approprié (100 excès de pli) quantité de globules rouges avec du PBS supplémenté avec 2% de FBS à trois reprises, la centrifugation à 1200 rpm pendant 10 minutes chaque fois.
3. Combinez les globules rouges avec des PBMC de l'étape 1.7 ou cellules élargi de l'étape 2.10 en PBS + 2% de FBS à un volume final de 1 mL par 5x10 ⁷ cellules de PBMC ou élargi.
4. Ajouter 1 microlitre d'RosetteSep  Cocktail homme NK enrichissement cellulaire par 1x10 ⁶ cellules de PBMC ou élargi.
5. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 20 minutes avec mélange en douceur toutes les 5 minutes.
6. Ajouter un volume égal de PBS + 2% SVF mélangez délicatement et la couche sur le dessus du Ficoll-Paque.
7. Répétez les étapes de centrifugation sur Ficoll-Paque décrit pour l'isolement des PBMC (Section I).
8. Compter les cellules NK récupéré après purification et mis de côté 5x105 cellules pour phenotpying par cytométrie en flux pour la pureté des cellules NK (étape 8).

5. Remarques

NOTE 1. Cellules NK peut être étendu directement à partir de PBMC, ou à partir de cellules RosetteSep  NK purifiées. Nous avons noté l'efficacité expansion similaire, mais certains donateurs peuvent avoir très faible nombre de cellules NK dans la purification résultant difficulté par RosetteSep avant l'expansion.

NOTE 2. Nous utilisons régulièrement CD56-FITC, CD16-PE, et CD3-PE-Cy5 pour le phénotypage pendant l'expansion, énumérant les cellules NK comme ceux qui sont CD3-CD16-négatives et ou CD56-positives.

NOTE 3. A chaque changement de support ou de stimulation, remettre les cellules à 2,5 x 10 ⁵ / ml pour maintenir le nombre de cellules PBMC / NK à ou moins de 2 millions par ml à des stades de pointe de l'expansion. Cela permettra d'éviter l'épuisement des nutriments et aider à réaliser l'expansion maximale et de survie.

NOTE 4. Le taux d'expansion NK est dépendante des donateurs et à la fin des stimulations 1 ou 2 une partie des cellules peuvent être congelées et une partie encore élargi en fonction de la nécessité d'expérimentation. Nous avons eu un bon succès dans l'utilisation des cellules congelées pour des extensions à une date ultérieure.

NOTE 5. Afin de permettre à l'erreur, nous vous recommandons d'utiliser un minimum de 7x10 ⁵ cellules NK remis en suspension dans 700 ULS du Nkem et 4x10 ⁵ calcéine-AM cellules cibles teinté remis en suspension dans 4 ml de Nkem de mise en place du test de cytotoxicité. Si vous utilisez pipette multicanaux pour l'ensemencement des cellules cibles des volumes plus élevés de cellules (jusqu'à 6x10 ⁵ à 6 ml) peuvent être nécessaires en fonction de la taille du bassin de média utilisé. Aussi le nombre des cellules NK sont recommandées spécifiquement pour le E: T ratios montrent dans le protocole, pour l'utilisation de plus E: T ratios augmententle nombre des cellules NK par mL en conséquence (par exemple pour un e 40:1: 4x10 T utilisent ratio de ⁶ cellules / ml)

NOTE 6. Nous vous recommandons d'effectuer au préalable calcéine-AM de chargement de titrage pour la lignée cellulaire cible de choix, en utilisant les dilutions suivantes de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 et 1:100 pour obtenir la différence entre la libération optimale maximale et spontanée.

NOTE 7. Lorsque vous utilisez une ligne de cellules adhérentes comme cible, d'abord préparer la suspension cellulaire unique à l'aide non-enzymatique des cellules tampon de dissociation. Si vous effectuez l'ADCC, de préparer un tube double de cellules cibles dans CAM-médias.

NOTE 8 Si vous effectuez l'ADCC, ajouter mêmes cellules NK à 3 puits correspondant à 10h01 E:. T pour l'ADCC. Répétez l'opération pour les bailleurs de fonds supplémentaires. Répétez l'opération pour les cellules cibles supplémentaires.

NOTE 9. Si vous effectuez une expérience ADCC, après 45 minutes de chargement calcéine, ajouter 10ug d'anticorps spécifiques pour induire l'ADCC contre les cellules cibles. Après 15 minutes de plus, se laver les cellules cibles dans un milieu complet à deux reprises, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. Resuspendre les cellules à 1x10 ⁵ cellules / ml et procéder à l'étape suivante dans le protocole.

6. Les résultats représentatifs

Figure 2. Lorsque l'expansion est réalisée selon le schéma décrit ci-dessus, en utilisant 5x106 PBMC comme matériau de départ, typiques des cellules NK large rendements de 1x10 ⁹ au ¹⁰ oct cellules (variabilité dépendante des donateurs). La figure montre l'expansion des cellules NK fois (n = 19) par rapport aux cellules NK présentes dans le produit original (médiane + / - quartile).

Figure 3. Les cellules NK expriment élargi différents récepteurs des cellules NK qui sont comparables à la non expansées primaires des cellules NK à quelques exceptions près (CD11b, CD160 et CD244).

Figure 4. Récupération PBMC de Buffy manteau est dépendante des donateurs et peut aller de ⁶ à 300x10 800x10 ^6. Les cellules NK peuvent comporter de 2% - 18% des PBMC. Pour la purification des cellules RosetteSep élargi, la récupération des cellules NK pures au jour 14 varie de 40-70%. En suivant le protocole recommandé d'expansion et de la purification, la pureté des cellules NK de 99% peut être attendue.

Figure 5. Élargi les cellules NK ont démontré une cytotoxicité contre une gamme de lignées cellulaires tumorales, y compris le neuroblastome, le LAM, l'ostéosarcome et le mélanome (représentant AML tuant montré que la lyse pour cent spécifiques).

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Anticorps	Volume par test	Société	Le numéro de catalogue
Tube 1	Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Tampon FACS Volume total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 Tampon FACS Volume total	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tube 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC Tampon FACS Volume total	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R & D Systems Miltenyi Biotec R & D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tube 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC Tampon FACS Volume total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tube 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 Tampon FACS Volume total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tube 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC Tampon FACS Volume total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42