L'utilisation d'un système de suspension de poids pour les Occlusion de l'artère rénale isolée

Résumé

Un modèle précis murin pour lésions rénales aiguës (IRA) en raison de l'ischémie est un outil important pour étudier les lésions rénales aiguës et, éventuellement, trouver des outils thérapeutiques pour traiter des lésions rénales. Le système de poids suspendu propose un outil pour occlusion de l'artère rénale immédiate et fiable et la reperfusion sans causer de congestion rénale.

Résumé

Chez les patients hospitalisés, plus de 50% des cas de lésions rénales aiguës (IRA) sont causées par une ischémie rénale ^1-3. Une étude récente de patients hospitalisés a révélé que seulement une légère augmentation de la créatinine sérique (0,3 à 0,4 mg / dl) est associée à un risque 70% plus de décès que chez les personnes sans aucune augmentation de ^1. Le long de ces lignes, les procédures chirurgicales nécessitant clampage de l'aorte et les vaisseaux rénaux sont associées à un taux d'insuffisance rénale pouvant aller jusqu'à 30% ^4. De même, AKI après une chirurgie cardiaque survient dans plus de 10% des patients dans des circonstances normales et est associée à une augmentation spectaculaire de la mortalité. AKI sont également des complications fréquentes après transplantation hépatique. Au moins 8-17% des patients finissent nécessitant une thérapie de remplacement rénal ^5. Par ailleurs, la fonction du greffon retardé en raison d'une lésion des cellules des tubules pendant la transplantation rénale est fréquemment liée à l'ischémie associée AKI ^6. Par ailleurs, AKI survient chez environ 20% des patients souffrant de sepsie ^6. La survenue d'AKI est associée à une augmentation spectaculaire de la morbidité et de mortalité ^1. Les approches thérapeutiques sont très limitées et la majorité des essais d'intervention dans AKI ont échoué chez les humains. Par conséquent, d'autres modalités thérapeutiques pour prévenir les blessures de l'ischémie rénale est urgent ^{3, 7-9.}

Pour élucider les mécanismes de lésions rénales dues à l'ischémie et les stratégies thérapeutiques possibles des modèles murins sont intensivement nécessaires ^7-13. Des modèles murins de fournir la possibilité d'utiliser différents modèles génétiques, y compris des gènes ciblés souris et tissu spécifique des gènes ciblés chez la souris (CRE-flox système). Toutefois, murin d'ischémie rénale est techniquement difficile et les détails expérimentaux influence significative sur les résultats. Nous avons effectué une évaluation systématique d'un nouveau modèle d'occlusion de l'artère rénale isolée chez la souris, ce qui évite notamment l'utilisation de serrage ou suturer les ¹⁴ pédicule rénal. Ce modèle exige une néphrectomie du rein droit, depuis l'ischémie peut être effectué que dans un rein en raison de la mise en expérimentation. En fait, en utilisant un système de suspension de poids, l'artère rénale est seulement instrumenté fois pendant toute la procédure chirurgicale. De plus, aucune obstruction veineuse ou urétral se produit avec cette technique. Nous avons pu démontrer temps-dose-dépendante et hautement reproductible des lésions rénales à l'ischémie par la mesure de la créatinine sérique. Par ailleurs, lorsque l'on compare ce nouveau modèle avec les classiques de serrage de l'ensemble du pédicule, la protection rénale par le préconditionnement ischémique est plus profonde et plus fiable. C'est pourquoi sa nouvelle technique pourrait être utile pour d'autres chercheurs qui travaillent dans le domaine des lésions rénales aiguës.

Protocole

Remarques générales. Toutes les opérations doivent être effectuées sous un microscope droit dissection (Leica) et en utilisant un coagulateur chirurgical. Les souris du groupe expérimental doit être adapté à l'âge et le poids pour assurer la comparabilité des résultats. L'administration de la température, la pression sanguine, l'anesthésie et le liquide doit être stable et surveillée pendant l'expérience.

1. L'anesthésie et la chirurgie

1. Expériences ischémie rénale peut être réalisée avec application simultanée d'ischémie et la reperfusion à la fois aux reins, ou après néphrectomie simple en combinaison avec le traitement de l'ischémie du rein restant. Comme le traitement d'ischémie bilatérale des deux reins est associée à une augmentation des difficultés techniques, un cadre plus complexe expérimental et plus la chirurgie, nous allons effectuer une néphrectomie droite suivie d'un traitement d'ischémie du rein restant laissé en utilisant un système de poids suspendu. Nous avons utilisé ce système de poids suspendus aussi pour occlusion de l'artère coronaire dans le cœur. Toutefois, la procédure est différente puisque l'artère rénale peut être isolé à partir des tissus environnants alors que les artères coronaires se trouve dans le muscle cardiaque.
2. Souris (8-14 semaines d'âge, soit le sexe) seront anesthésiés avec du pentobarbital à la dose de 70mg/kg. Nous allons maintenir l'anesthésie avec env. 10 mg / kg / h de pentobarbital de sodium. Un surdosage peut considérablement diminuer la pression artérielle et peut donc modifier les résultats. Dans nos études initiales nous avons également utilisé la kétamine et de xylazine. Cependant, ces composés induit une bradycardie forte (150 / min). A côté de la bradycardie observée il ya aussi des preuves que les deux composés sont impliqués dans les mécanismes de protection dans des conditions d'ischémie. Les anesthésiques volatils peuvent pas être utilisés soit en raison de leur capacité à induire également une protection rénale et une pression artérielle basse. C'est pourquoi notre choix final pour l'anesthésie a été pentobarbital. En outre, la kétamine et de xylazine sont principalement excrétés par les reins. Néphrectomie et l'ischémie peut prolonger l'anesthésie kétamine.
3. Une fois la douleur réflexes sont absents (testé en serrant les orteils avec des pincettes) souris sera placé sur une table chauffante à température contrôlée (RT, Effenberg, Munich, Allemagne afin de maintenir la température du corps à 37,0 ° C) dans une position de décubitus latéral gauche.
4. Fixez les extrémités inférieures et supérieures à la table en utilisant du ruban.
5. Pour les non-survie chirurgies, comme indiqué dans la vidéo de démonstration, couvrir la zone d'incision avec de l'huile minérale pour éviter l'inhalation de poils de souris en découpant la peau et prévenir ainsi les risques d'allergies poils de souris. En cas d'expériences de survie correcte des techniques d'asepsie, y compris écrêtage des cheveux, désinfection de la peau avec des iodophores (Bétadine, par exemple), la manipulation d'instruments stériles à l'autoclave et l'utilisation des masques une des gants stériles pour le chirurgien sont nécessaires. L'huile minérale n'est pas utilisé dans les cabinets de survie. Pour la survie de chirurgies stériles NaCl est utilisé
6. Incision du flanc droit sera effectué avec un ciseau et une électrode de coagulation (Erbe, ICC50, Allemagne) pour prévenir les saignements des muscles et vaisseaux de la peau. Contrairement à l'accès via les reins laparotomie médiane, cette technique ne nécessite pas d'accès à la cavité péritonéale.
7. Le pédicule rénal, y compris l'artère rénale et la veine rénale sont ligaturés à l'aide d'une suture 4 / 0 de la soie et le rein droit va être coupé avec des ciseaux, sans interférer avec les vaisseaux surrénales.
8. La plaie chirurgicale est fermée à l'aide de suture continue (deux points) de la paroi musculaire et la peau avec une suture 4 / 0.
9. Les animaux sont ensuite placés dans une position de décubitus latéral droit et une incision flanc gauche sera effectuée.
10. Le rein gauche est soigneusement enlevé les tissus conjonctifs, en évitant les glandes surrénales et les vaisseaux.
11. Ensuite, le rein est tourné avec sa face ventrale vers le bas dans une tasse de lucite. La tasse de lucite doivent être stérilisés pour les chirurgies de survie. Le pôle du rein est délicatement poussé dans la tasse lucite par la tenue des tissus environnants avec une pince. Par la suite, le pôle est soigneusement poussé dans la tasse lucite avec une pince. Le rein sera maintenu humide et chaud avec un tampon humide imbibé d'eau à 37,0 ° C.
12. Après l'exposition du rein gauche et le placement dans une tasse de lucite le titulaire du rein est retenu ventralement à avoir une tension sur les vaisseaux rénaux. Une retenue suffisante est important pour un placement réussi de la suture sous l'artère rénale. Par la suite, le titulaire du rein est fixe et l'artère rénale peut être facilement identifié car il fonctionne sur le dessus de la veine rénale.
13. L'artère rénale est disséqué à partir des tissus adjacents, près de son décollage de l'aorte abdominale avec une pince fine. L'artère est disséquée de la veine sous-jacent avec une pince courbe au sommet.
14. Une suture 8 / 0 de la soie (Ethicon, Norderstedt, Allemagne) est placé sous l'artère rénale en utilisantune pince comme un guide de premier plan. Cette technique permet l'interruption de seulement le flux sanguin artériel vers le rein sans compression de la veine rénale, comparativement à serrage du pédicule rénal.
15. La suture est placé sur un poteau de petite taille (peut être une épingle de sûreté préparés) et un poids d'env. 1g est fixée à chaque extrémité (tube Eppendorf). Le poids peut être adapté à la taille des reins en retirant ou en ajoutant de l'eau dans les tubes Eppendorf. Toutefois, l'artère doit être légèrement tiré vers le haut, de sorte que le sang ne fonctionne grâce à l'artère, mais sans stretch majeur sur l'artère. Le stress étirer majeur sur l'artère peut causer des dommages paroi de la cuve avec un épaississement de la paroi artérielle et de la reperfusion réduit.
16. Alors que les poids ne sont pas supportés, l'artère rénale est immédiatement occlus. En revanche, lorsque les poids sont pris en charge, le débit sanguin est immédiatement rétabli à l'orgue. L'occlusion réussie est confirmée par un changement de couleur du rouge au blanc.
17. Différents temps de l'ischémie peut être effectuée tel que requis par l'expérience. Une reperfusion complète aura lieu en fonction de la longueur de la durée de l'ischémie. Ischémie fois jusqu'à 45 minutes permettent lésions rénales recouvrable. Dans notre cadre expérimental, nous avons utilisé 20 jusqu'à 30 minutes d'ischémie avec une blessure rénale moyenne qui nous permet de voir l'amélioration ainsi que les dépréciations de dommages aux reins, selon la souche de souris et le traitement.
18. Après reperfusion complète du rein peut être remplacée par de la coupe de lucite. Par conséquent, le détenteur de rein est non fixée et la tension sur le rein est libéré. Le pôle crânienne est doucement retiré de la tasse avec une pince fade et du pôle caudal suit immédiatement.
19. La fixation (bandes) de la souris peut être libéré et de la souris peut être placé en position couchée pour les ex-FITC inuline dédouanement étiquetés.
20. En sous-ensembles d'expériences, la pression artérielle et du rythme cardiaque peuvent être enregistrées tout au long de la procédure chirurgicale. Mesures de pression artérielle sont obtenues en continu via un cathéter dans l'artère carotide. En bref, l'artère carotide est exposé via dissection des muscles paratrachéal. Après une nouvelle exposition et l'évitement prudent de traumatisme tissulaire (notamment du nerf vagal), un cathéter est introduit dans le vaisseau en utilisant deux points de suture et une petite pince. La pression artérielle est mesurée avec un élément de Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Suisse).
21. Pour marqués au FITC clairance de l'inuline un cathéter doit être placé dans la veine jugulaire gauche pour perfusion de chlorure de sodium et d'inuline marquée au FITC. De plus, une sonde vésicale doit être insérée pour la collecte de l'urine d'une manière dépendante du temps, comme expliqué ci-dessous en détail.

2. Mesure des lésions rénales

1. En général: Les paramètres de résultats suivants sont recommandés afin de déterminer les lésions rénales suite d'une ischémie rénale:
   Effectuer marqué FITC clairance de l'inuline pour évaluer le taux de filtration glomérulaire (DFG). Comme une alternative de déterminer clairance de la créatinine et la créatinine sérique au moyen enquête cage métabolique 24 heures suivant une lésion rénale. Effectuer rénale coloration H & E et une myéloperoxydase (MPO) ELISA pour déterminer les lésions rénales et de l'inflammation 24 heures suivant l'ischémie rénale.
2. Enquêtes cage métabolique:
   1. Suite à l'ischémie, le rein gauche est tourné dans la position rétropéritonéale et la plaie est fermée comme décrit ci-dessus.
   2. A la fin de la chirurgie souris reçoivent 0,3 ml de sérum physiologique IP et de récupérer pendant 2 heures sous une lampe chauffante.
   3. Par la suite, les souris seront placées dans des cages métaboliques (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Allemagne) pour la détermination des paramètres fonctionnels rénaux pour les deux périodes de 24 heures.
   4. La prise d'eau de chaque souris doit être déterminée par pesée de la bouteille vide et rempli d'eau avant l'offre à la souris et de 24 heures plus tard, en pesant la bouteille pleine à nouveau. Le poids de la souris doit être déterminé aussi.
   5. Après 24 heures environ 75μl de sang sont tirées du plexus veineux derrière l'œil par un tube capillaire sous anesthésie isoflorane court.
   6. La fonction rénale est évaluée par la mesure du plasma et l'urine de la créatinine 24 heures après une ischémie rénale en utilisant une méthode commercialement disponible colorimtric selon le fabricant de l `protocole (LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Allemagne). Concentrations plasmatiques et urinaires de Na ^+, K ⁺ sont déterminées avec un photomètre d'émission de flamme (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne). Excrétion rénale et les valeurs hémodynamiques sont calculées en utilisant des formules standard ^15-17.
3. Clairance de l'inuline: expériences dédouanement FITC-inuline sera effectuée après ischémie rénale.
   1. La veine jugulaire gauche est canulée pour i continuenFusion. Après dissection de la veine du tissu adjacent avec un ciseau de préparation (Dumont, WPI) placer deux points de suture (4 / 0) autour de la veine. Placer une pince sur la veine avant la suture proximale pour arrêter l'écoulement du sang. Par la suite, fermer le noeud distal et placer un poids sur l'un des extrémités distales de suture à la souche de tension sur la veine. Ceci est très important pour obtenir le cathéter dans la veine. Utiliser un micro-ciseaux pour couper une petite ouverture dans la veine. Tenir l'ouverture avec une pince fine (Dumont, WPI) et place le cathéter dans la veine. Pour faire avancer le cathéter de prendre la pince hors tension. Assurez-vous qu'il n'y a aucune tension sur le cathéter de sorte que vous pouvez le placer sans elle maintenant. Par la suite fermer la deuxième suture proximale sur la veine et le cathéter.
   2. Un cathéter est placé dans la vessie pour la collecte de l'urine chronométré. Par conséquent, vous coupez une courte incision dans la peau au cours de la vessie. Retirez soigneusement la vessie à travers le trou peau. Fixer la vessie avec un tissu humide. Placer une suture préparés au cours de la vessie (4 / 0).
   3. Coupez un petit morceau d'un cathéter (1,5 cm) et de la chaleur sur la fin pour obtenir un anneau autour du cathéter qui rend plus facile de le fixer dans la vessie.
   4. Coupez un trou dans la vessie à sa très haut. Faire la coupure entre les navires pour prévenir les saignements. Insérez le gros bout du cathéter dans la vessie et à proximité de la suture sur le cathéter et la vessie.
   5. Toutes les souris ont reçu un bolus de solution de chlorure de sodium 0,85% pour un montant égal à 20% du poids corporel. La perfusion continue est maintenue à un taux de 800ul/h/25g poids corporel et de FITC-inuline est ajoutée à la perfusion de l'évaluation du taux de filtration du rein toute glomérulaire (DFG). Après stabilisation de l'animal pendant 20 min, 20 min collections d'urine sont effectués chronométrés (quatre fois) pour la détermination du débit urinaire et FITC-inuline. Le sang est obtenu dans le milieu de chaque période de mesure de la FITC-inuline.
   6. Lors du démarrage de la période de collecte pendant 20 minutes l'utilisation d'une minuterie. Recueillir les urines en plaçant l'extrémité du cathéter vésical dans un petit tube eppendorf. Mesurer le poids du tube avant et après la collecte d'urine de sorte que vous pouvez déterminer la quantité d'urine. Des échantillons de sang sont prises via le formulaire de collecte de sang rétroorbital le plexus veineux par des tubes capillaires dans le milieu de chaque période de collecte.
4. Sang et le rein peuvent être collectées après chaque procédure pour une analyse plus poussée, par exemple MPO ELISA, cytokine EISA, l'histologie.

3. Les résultats représentatifs:

Figure 1 Modèle d'un système d'accrochage de poids pour une ischémie rénale:. Un système de poids suspendu a été établi pour induire une ischémie rénale du rein gauche. Par conséquent, une suture de nylon 8,0 a été placé sous l'artère rénale et à la fin de chaque suture un petit poids (1g) a été fixé. Ce dispositif expérimental permet l'occlusion réversible de l'artère rénale en appliquant et en libérant la charge de poids.

Discussion

En résumé, la présente étude décrit une nouvelle technique pour réaliser une ischémie rénale dans un modèle murin utilisant un système de suspension-poids pour occlusion de l'artère rénale. En fait, cette étude démontre blessures hautement reproductible, minimisant ainsi la variabilité associée à serrage du pédicule rénal.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Pentobarbital sodique	Ls Vortech pharmaceutique, Ltd	VPL 9372	4mg/mL dans une solution saline
Suture, soie 4,0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolène 8.0	Ethicon, USA	M8739	réutilisables
microscope à dissection	Leica	n / a	considère la distance de travail généreuse
Tableau de chauffage	Rt, Effenberger, Allemagne	n / a	fournisseur de la seule et unique
Les instruments chirurgicaux	WPI, Dumont		un ciseau microvaisseaux fines