Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Résumé

Optique résolution microscopie photoacoustique (OR-PAM) est une technologie émergente capable d'imagerie d'absorption optique des contrastes In vivo Avec une résolution cellulaire et la sensibilité. Ici, nous fournissons une instruction visualisées sur les protocoles expérimentaux d'OR-PAM, y compris la configuration du système d'alignement, typique In vivo Procédures expérimentales, et les systèmes d'imagerie fonctionnelle.

Résumé

La microscopie optique, fournissant des indications précieuses aux niveaux cellulaire et des organites, a été largement reconnue comme une technologie habilitante biomédicale. Comme les piliers de in vivo en trois dimensions (3-D) microscopie optique, microscopie par fluorescence et single-/multi-photon tomographie par cohérence optique (OCT) ont démontré leur sensibilité aux contrastes extraordinaires diffusion de fluorescence et d'optique, respectivement. Cependant, le contraste d'absorption optique des tissus biologiques, qui encode l'information essentielle physiologiques / pathologique, n'a pas encore été évaluables.

L'émergence de photoacoustique biomédicales a conduit à une nouvelle branche de la microscopie optique à résolution microscopie optique photoacoustique (OR-PAM) ^1, où l'irradiation optique est centré à la limite de diffraction de réaliser ^une cellulaires ou même ^une résolution de ² subcellulaire niveau latéral. Comme un complément précieux aux technologies existantes microscopie optique, OU-PAM apporte au moins deux nouveautés. D'abord et surtout, OU-PAM détecte les contrastes d'absorption optique avec une sensibilité extraordinaires (100%). Combinaison ou-PAM avec la microscopie par fluorescence ³ ou avec optique de diffusion basée sur le ^{4 octobre} (ou les deux) offre une gamme complète propriétés optiques des tissus biologiques. Deuxièmement, OU-PAM encode absorption optique en ondes acoustiques, par opposition à des processus purement optiques en microscopie à fluorescence et les PTOM, et fournit des informations sans détection. La détection acoustique en OU-PAM atténue les effets de diffusion optique sur la dégradation du signal et élimine naturellement les interférences possibles (ie, crosstalks) entre excitation et de détection, qui est un problème commun dans la microscopie par fluorescence en raison du chevauchement entre les spectres d'excitation et de fluorescence.

Unique pour l'imagerie d'absorption optique, OU-PAM a démontré large éventail d'applications biomédicales depuis son invention, y compris, mais non limité à, la neurologie ^{5, 6,} ophtalmologie ^{7, 8, 9} biologie vasculaire, et ¹⁰ en dermatologie. Dans cette vidéo, nous enseignons la configuration du système et l'alignement des OU-PAM ainsi que les procédures expérimentales pour l'imagerie in vivo microvasculaire fonctionnelle.

Protocole

1. La configuration du système

1. L'irradiation optique
   1. Source d'irradiation optique: une diode-pompé à l'état solide laser pulsé (INNOSLAB, Edgewave) et un laser à colorant (CBR-D, Sirah).
   2. Le faisceau de sortie laser (largeur d'impulsion: 7 ns) est focalisé par une lentille condenseur (LA1131, Thorlabs) de passer à travers un sténopé de 50 um (P50C, Thorlabs).
   3. Le sténopé est positionné un peu loin du centre de la lentille de condenseur pour correspondre au diamètre sténopé avec le diamètre du faisceau fondamental du mode de filtrage efficace de l'espace.
   4. Le faisceau filtré est atténué par un filtre de densité neutre (NDC-50C-2M, Thorlabs) et ensuite couplé dans une fibre optique monomode (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. La sortie de fibre remplit l'ouverture arrière d'un objectif de microscope (RMS4X, Thorlabs) pour atteindre un accent limitée par la diffraction optique de ~ 2,6 um à la longueur d'onde de 570 nm.
2. De détection à ultrasons
   1. Transducteur ultrasonique: 50 MHz de fréquence centrale (V214-BB-RM, Olympus NDT-).
   2. Le transducteur ultrasonique est attaché à un combineur home-made-acoustiques faisceau optique ¹¹ pour détection à ultrasons, qui est aligné coaxialement avec la diffraction limitée irradiation optique.
   3. Une cavité sphérique est une terre hors du fond du combineur pour produire une lentille acoustique. Cette lentille acoustique a une ouverture numérique de 0,5 dans l'eau et donne un diamètre acoustiques focal de 43 um à la fréquence 50 MHz centrale.
   4. Les foyers optique et acoustique sont alignés confocally afin de maximiser la sensibilité de détection.
3. Couplage acoustique
   1. Dry couplage ultrasons est utilisé pour éviter les submergeant les animaux de laboratoire dans l'eau, qui a été utilisé dans les premiers systèmes d'imagerie photoacoustique ^12.
   2. Une fenêtre d'imagerie est ouverte dans le fond d'une boîte de Petri (9 cm de diamètre) et est scellé avec une membrane de polyéthylène transparent et optiquement par ultrasons.
   3. Gel ultrasons (image claire, Sonotech) entre la membrane de polyéthylène et de l'objet à imager les couples l'onde générée photoacoustique de l'objet à la boîte de Petri, et de l'eau déminéralisée dans la boîte de Pétri couples encore la vague de la submergés ou-PAM tête d'imagerie .
4. Electronics
   1. Le signal photoacoustique détectée par le transducteur ultrasonique est amplifié par deux amplificateurs en cascade (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. Le signal amplifié est numérisé par une acquisition à 14 bits de données (DAQ) conseil (CompuScope 14200, Gage Applied Sciences) à un taux d'échantillonnage de 200 Méch / s.
5. Balayage schéma
   1. Deux dimensions (2-D) raster scan de la tête ou le long-PAM d'imagerie à l'horizontale (xy) avion est contrôlé par un ordinateur personnel, ce qui déclenche la fois la carte DAQ et le laser de pompe. Le signal de déclenchement est synchronisé avec le signal d'horloge-out de la carte DAQ.
   2. L'axe rapide du scanner 2-D est définie comme la direction de l'analyse transversale (B-scan).
   3. Une séquence de B-scan images peuvent être acquises en traduisant la tête d'imagerie selon l'axe lent pour former une image volumétrique, qui peut être consulté directement, soit dans un 3-D de rendu ou dans une projection 2-D d'amplitude maximale (MAP) image .

2. Système d'alignement

1. Utilisez impulsion-écho des ultrasons et un réflecteur à ultrasons pour déterminer la position de l'avion acoustiques focale (ie, le temps de retard à partir du signal de déclenchement pour le maximum d'impulsion-écho du signal ultrasonique). Cette étape est nécessaire d'être effectuée qu'une seule fois lors de la construction du système OU-PAM.
2. Maximiser l'efficacité du couplage de la fibre monomode.
3. Appliquer le gel à ultrasons sur le dessus d'un objet optiquement absorbante (par exemple, un morceau de ruban adhésif noir) et doucement l'attacher sous la fenêtre d'imagerie dans la boîte de Pétri remplie d'eau déminéralisée.
4. Abaissez la tête d'imagerie dans l'eau, et éliminer les bulles d'air emprisonnées sous la lentille acoustique.
5. Ajuster la tête d'imagerie que le signal photoacoustique de l'objet d'absorption est de l'avion acoustiques focale, ce qui peut être jugé du retard acoustique.
6. Ajustez la position verticale (ie, la position z) de l'objectif du microscope afin de maximiser l'amplitude du signal photoacoustique générées par l'objet plat. L'amplitude du signal optimisée suggère que le foyer optique est aligné avec le centre acoustique dans le sens vertical.
7. Ajustez la position horizontale (ie les positions X et Y) de l'objectif du microscope jusqu'à ce que le signal de photoacoustique générés par la cible montre un schéma symétrique. La symétrie suggère que le foyer optique est aligné avec le centre acoustique dans le sens horizontal.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 jusqu'à ce que le signal de photoacoustique est optimisé à la fois dans la symétrie et l'amplitude.

3. Une SA mple procédure en expérimentaux in vivo ou-PAM d'oreille de souris vascularisation

1. Cette étape n'est pas nécessaire pour la souris nude. Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d'un cocktail [Recette: 1 ml de kétamine (100 mg / ml), 0,1 ml de xylazine (100 mg / ml), et 8,9 ml de solution saline; posologie: 0,1 ml/10 g]. Raser les poils de l'oreille, et encore épiler les poils résiduels à la crème Surgi (catégorie #: 82565, American International Industries) avant de le nettoyer avec de l'eau déminéralisée. Notez que l'épilation telles pourraient légèrement irriter la peau et donc la vascularisation est préférable d'effectuer 24 heures avant l'expérience envisagée.
2. Allumez le système laser photoacoustique, et vérifier l'alignement du système.
3. Anesthésier la souris avec 3% d'isoflurane vaporisée par l'inhalation de gaz (le débit typique est de 1,0 à 1,5 l / min, selon le poids corporel de l'animal), et de maintenir l'anesthésie avec l'isoflurane à 1% durant l'expérience. Qualité médicale de l'air est recommandé que le gaz d'inhalation pour maintenir la souris à l'état physiologique normal.
4. Transfert de la souris à un stade stéréotaxique, et de contrôler sa température corporelle à 37 ° C avec un coussin chauffant.
5. Aplatir l'oreille de la souris sur une plaque de plastique et d'appliquer une couche de gel échographique sur le dessus de l'oreille. Eviter d'emprisonner des bulles d'air à l'intérieur du gel. Ensuite, placez l'oreille sous la fenêtre d'imagerie et soulevez lentement la scène des animaux jusqu'à ce que le gel à ultrasons contacts au bas de la membrane de polyéthylène. Contact souples est nécessaire car en appuyant sur l'oreille contre la membrane peut affecter le flux de sang dans l'oreille.
6. Pince un oxymètre de pouls à la jambe ou la queue de la souris pour contrôler son état physiologique, et appliquer la pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse et les dommages accidentels au laser pour les yeux de la souris.
7. Abaissez la tête jusqu'à ce que l'imagerie lentille acoustique est immergé dans l'eau déminéralisée, et éliminer les bulles d'air emprisonnées sous la lentille acoustique.
8. Vérifiez la fluence laser afin de s'assurer qu'il est conforme aux normes de sécurité laser de la American National Standards Institute ^13. La fluence laser ne doit pas dépasser 20 mJ / cm ^2, ce qui se traduit par 80 nJ des impulsions laser d'énergie lorsque le faisceau laser est focalisé à 150 um sous la surface de la peau.
9. Réglez le laser à la mode externe de déclenchement et de lancer la numérisation procès. Ajustez la position z de la tête de l'imagerie jusqu'au signal le plus fort photoacoustique est du plan acoustique focale.
10. Réglez les paramètres de numérisation correcte et commencer l'acquisition d'image formelle.
11. Après l'expérience, éteindre le laser, lever la tête d'imagerie de l'eau déminéralisée, baissez le stade animal pour libérer la souris, nettoyer l'oreille de souris avec de l'eau déminéralisée, éteignez le système d'anesthésie et le contrôleur de température, et de décharger la souris de l'étape de stéréotaxie.
12. Si l'imagerie répétitive est nécessaire, de mettre la souris dans un incubateur à la température ambiante fixée à 37 ° C. Retour de la souris à l'animalerie après qu'il se réveille naturellement. Sinon, suivez les protocoles animal à euthanatize et de s'en débarrasser.

4. Fonctionnelle ou-PAM de la concentration totale et la saturation en oxygène de l'hémoglobine

1. Oxyhémoglobine (HbO ₂₎ et désoxyhémoglobine (HBR) sont les deux principales formes de l'hémoglobine, la principale source endogène photoacoustique dans le domaine spectral visible. HbO ₂ et HBr sont distinctes des spectres d'absorption optique et peut donc être différenciée spectralement à quantifier à la fois la concentration totale (HBT) et la saturation en oxygène (SO ₂₎ de l'hémoglobine ^5. Voici deux lignes directrices pour aider choisir la bonne longueur d'onde optiques pour le SO ₂ mesures:
2. Les longueurs d'onde doit être choisi au sein du Q-bandes du spectre d'absorption d'hémoglobine (soit 550 à 600 nm) pour assurer un nombre suffisant de signal-bruit et la pénétration adéquate.
3. Les longueurs d'onde où les coefficients d'absorption de HbO ₂ et HBr ont une différence marquée (par exemple, HBr-dominante 561 nm et HbO _2-dominante 578 nm) sont recommandés.

Outre SO _2, HBT peut être calculé en ajoutant [HbR] et [HbO _2] ensemble, ou il peut être directement mesurée à des longueurs d'onde des spectres isobestique coefficient d'extinction molaire de l'hémoglobine (par exemple, 530 nm, 545 nm, 570 nm, et 584 nm) ^14, où HBr et HbO ₂ ont les mêmes coefficients d'extinction molaire.

5. Les résultats représentatifs:

Montre la figure 1 est l'anatomie vasculaire et de SO ₂ dans une oreille de souris nude de vie imagée par double longueur d'onde (561 et 570 nm) ou-PAM. Le temps de l'image typique d'acquisition de double longueur d'onde sO ₂ mesures d'une telle région d'intérêt (taille de l'image: 10 mm x 10 mm; taille de pas: 2,5 um x 5 um) est ~ 80 min.

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Figure 1. In vivo optiques résolution microscopie photoacoustique. MAP: de (A) la concentration d'hémoglobine totale montrant l'anatomie vasculaire (acquis à 570 nm) et (B) de la saturation en oxygène l'hémoglobine (acquis à 561 nm et 570 nm) dans une oreille de souris nude. (C) Gros plan sur la région encadrée dans le panneau (A). La barre d'échelle dans le panneau (A) s'applique à la fois (A) et (B).

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Discussion

Dans cette vidéo, nous fournissons des instructions détaillées sur les protocoles expérimentaux d'OR-PAM, y compris la configuration du système, l'alignement du système et des procédures expérimentales typiques. Sans étiquette, non invasive ou-PAM a permis d'études du fonctionnement microvasculaires et le métabolisme sur une seule base capillaire et détient de ce fait le potentiel d'élargir notre compréhension de la microcirculation liés physiologie et la pathologie. Microphotoacoustics fa...

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