Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l'image terminaisons présynaptiques

Résumé

Ce rapport démontre une technique d'isolation mécanique de neurones individuels viables conservant attachés boutons présynaptiques. Vibrodissociated neurones ont l'avantage d'une production rapide, un excellent contrôle pharmacologique et amélioré l'espace-pince sans influence des cellules voisines. Cette méthode peut être utilisée pour l'imagerie des éléments synaptiques et patch-clamp.

Résumé

Dissociation mécanique des neurones du système nerveux central a l'avantage de boutons présynaptiques restent attachés à la neurone isolé de l'intérêt. Cela permet à l'examen de la transmission synaptique dans des conditions où les environnements extracellulaires et intracellulaires postsynaptique peut être bien contrôlé. Une technique basée sur les vibrations sans l'utilisation de protéases, connu sous le nom vibrodissociation, est la technique la plus populaire pour l'isolation mécanique. D'une micropipette, avec la pointe polie au feu à la forme d'une petite balle, est placé dans une tranche de cerveau fait à partir d'un P1-P21 rongeurs. La micropipette est vibré parallèle à la surface tranche et abaissé grâce à l'épaisseur de coupe résultant de la libération de neurones isolés. Les neurones isolés sont prêts pour des études au sein de quelques minutes de vibrodissociation. Cette technique a des avantages sur l'utilisation de cultures primaires de neurones, des tranches de cerveau et les neurones isolés enzymatiquement, notamment: la production rapide de viabilité, les neurones relativement matures appropriés pour des études électrophysiologiques et d'imagerie, le contrôle supérieur de l'environnement extracellulaire libre de l'influence des cellules voisines; adéquation pour le bien-contrôlé expériences pharmacologiques en utilisant l'application rapide du médicament et de surfusion total de cellules, et l'amélioration espace-clamp dans la cellule entière par rapport à des enregistrements de neurones dans des préparations ou des tranches de culture cellulaire. Cette préparation peut être utilisée pour examiner synaptique physiologie, la pharmacologie, la modulation et la plasticité. Imagerie en temps réel de ces deux éléments pré-et post-synaptiques dans les cellules vivantes et boutons est également possible en utilisant les neurones vibrodissociated. Caractérisation des constituants moléculaires des éléments pré-et post-synaptiques peuvent également être obtenus avec des approches immunologiques et fondés sur l'imagerie.

Protocole

1. Préparation scellées à la flamme micropipette de verre

1. L'utilisation de verre de microélectrodes, tirez une norme de patch-clamp sur une micropipette Flaming-Brown ou équivalent extracteur micropipette (pointe de diamètre ~ 2 um). Micropipette Placez la pointe dans la flamme d'un brûleur Bunsen pour ~ 2 sec jusqu'à obtention d'une boule de fusion avec un diamètre de 200-300 um.
2. Placez scellées à la flamme pipette patch sur support sur un micromanipulateur qui peuvent être rapidement vibré côte à côte (distance à parcourir 100-200 pm) en utilisant un piézo bimorphe, relais, ou d'un dispositif de façon équivalente efficace.

2. Préparation des tranches de cerveau de P1-P21 rats ou des souris

1. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) avec la composition suivante (en mM): 124 NaCl, KCl 4,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, et 10 D-glucose. Solution à bulles avec de l'oxygène à 95% / 5% de CO ₂ de gaz pour environ 15 min, puis ajoutez 2 _mM de CaCl2 et MgCl2 1 _mM.
2. Couper des tranches de cerveau:
   1. Anesthetize animal avec l'halothane ou l'isoflurane. Décapitez animaux - enlever le cerveau - le cerveau de bloc dans l'orientation désirée (coronale, parasagittale, transversales, etc) afin d'inclure des régions d'intérêt.
   2. Apposez le cerveau bloqué à l'étape d'une trancheuse cerveau vibrant immergé dans aCSF - cerveau section à 250-400 um d'épaisseur - Placer les tranches de aCSF buller avec carbogène dans un "pré-incubation" chambre sur la compensation qui permet de fluide / exposition au gaz sur toutes les surfaces - permettent d'équilibrer les tranches dans ce milieu pendant au moins une heure.

3. Vibrodissociation

1. Remplir un plat de 35 mm de diamètre culture avec HEPES solution saline tamponnée de composition suivante (mm): 150 NaCl, KCl 5, 10 HEPES, 1 _MgCl2, 2,5 _CaCl2, 10 D-glucose avec pH ajusté à 7,4 en utilisant NaOH et osmolarité ajusté à ~ 300 mOsm en utilisant le saccharose. Des boîtes de culture peuvent être plats de suspension, la norme boîtes de culture cellulaire, des boîtes de culture avec des inserts lamelle de verre, ou des plats revêtus de, par exemple, le poly-L-lysine, selon la nécessité de respecter forte cellulaire au fond plat.
2. Placez la tranche dans la boîte de culture et de visualiser avec un stéréoscope disséquer à 250 x. Tenez tranche vers le bas en utilisant un fil de platine plié (0,5 mm de diamètre) placés sur la surface supérieure de la tranche d'agir comme un poids.
3. Position de la pointe de la micropipette scellées à la flamme sur la surface de tranche dans la région du cerveau désirée. Activer micromanipulateur à vibrer l'extrémité latérale à 10-30 Hz, avec une distance d'excursion ~ 100 um. Utilisation du micromanipulateur, déplacer la pointe plus profondément dans le tissu tranche de telle sorte qu'il passe à travers la tranche entière dans ~ 30 sec. Répétez cette étape si nécessaire pour maximiser le nombre de neurones isolés obtenu à partir d'une région cérébrale donnée.
4. Enlevez l'extrémité de la tranche - ramasser les tranches avec une pince et secouez-la délicatement tout en solution - puis retirez et jetez tranche complètement.
5. Autoriser les cellules dissociées à s'établir et à adhérer au fond plat pour au moins 10 min.

4. Enregistrement électrophysiologique

1. Placer le plat contenant des neurones sur la scène d'un microscope inversé et de visualiser avec 10 à 63 x objectif x. Regarde pour les neurones avec une membrane de brevets en douceur, sans bourgeonnement, et un noyau détectable mais pas surdimensionné. Si l'optique à contraste de phase sont utilisées, regardez pour la phase-lumineux neurones avec une teinte jaunâtre, pas trop bleu. Cellules avec une solution Superfuse extracellulaire contenant des sels désiré, les nutriments, les antagonistes des récepteurs, etc (notre standard est la solution saline tamponné HEPES mentionnés ci-dessus (article 3.1)), souvent complété avec 5 uM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tétrahydrobenzo [f] quinoxaline-7-sulfonamide uM disodique (NBQX), et de 25 à 100 D-2-amino-5-phosphonopentanoic acide (AP5) pour bloquer les récepteurs ionotropiques du glutamate qui permet d'isoler rapidement GABA _Un CISP médiée par le récepteur ^1,2.
2. Tirez une micropipette de patch standard en utilisant un extracteur Flaming-Brown ou équivalent. Pipette résistance doit être 2-4 MQ (selon la taille de la cellule cible) lorsqu'ils sont remplis avec un Cl ^{- -} ​​solution basée.
3. Etablir un enregistrement cellule entière à partir d'un neurone visualisés en utilisant des techniques standard de électrophysiologiques.
4. Enregistrement spontanée courants postsynaptiques (sPSCs) en utilisant un écart sans protocole d'acquisition de données. Appliquer 0.2 à 1 uM tétrodotoxine et / ou faible teneur en Ca ^{2 +} - contenant une solution extracellulaire pour enregistrer miniatures courants postsynaptiques (mPSCs).
5. Solutions et agents pharmacologiques peuvent être directement appliqués aux cellules. Nous utilisons surfusion locale à partir des tubes en verre fusionné carré incliné avec l'échange solution impliquant le déplacement latéral de la tuyauterie montée sur un micromanipulateur stepper-moteur. Cette alloa été pour l'échange de solution dans de 10s à 100s de MS pour obtenir des changements rapides dans le contenu moléculaires extracellulaires, l'application d'agonistes des récepteurs, etc
6. Akaike et ses collègues ont développé des techniques pour stimuler la seule boutons présynaptiques ^3,4. Une micropipette est placé près d'un bouton de visualiser et de stimulation est donnée (courants stimulus négatif de 5-10 pA, 0,1-0,2 ms). CISP unitaires sont enregistrés, et des méthodes telles que la méthode d'échecs peuvent être utilisés pour examiner les changements dans la fonction présynaptique et postsynaptique.

5. Bornes d'imagerie présynaptiques

1. Neurones postsynaptiques peuvent être remplies avec divers colorants via la pipette de patch. Les neurones peuvent également être fabriqués à partir de souris exprimant des protéines fluorescentes (PC) comme la protéine fluorescente verte (GFP) dans certaines populations cellulaires.
2. Terminaux présynaptiques peuvent être visualisées sur des neurones de souris fait vibrodissociated qui expriment MF dans les populations interneurone particulier. Par exemple, des souris exprimant la GFP entraîné par le glutamate décarboxylase 65 (GAD65) soma montrent promoteur vertes et des processus dans les cellules de l'hippocampe et les interneurones panier d'autres. Vibrodissociated neurones pyramidaux de la région CA1 hippocampique ont terminaisons axonales GFP-positives à leurs apposed soma et des dendrites proximales (figure 1A). Neurones pyramidaux vibrodissociated de souris qui expriment synaptopHlourin (un pH-sensibles GFP mutante fusionnée à la vésicule synaptique associée VAMP2 protéines) sous contrôle du promoteur Thy1 ont également boutons FP-positives attachées qui montrent une fluorescence pH-sensibles (figure 1B).
3. Boutons présynaptiques peut être chargé avec des colorants indicateurs de calcium et d'autres molécules fluorescentes utilisant AM-estérifiés composés ^5. La figure 2 montre un exemple de chargement utilisant le colorant de calcium-indicateur Fluo4-AM. Tout d'abord, uM 1-2 AM-estérifiés colorant est appliqué à des neurones à 37 ° pendant 10 min. Dye peut pénétrer dans le milieu intracellulaire, où estérases cliver la molécule, ce qui donne, sans colorant cellulaire imperméants et inassouvi. Cette approche à la fois les charges d'éléments pré-et post-synaptiques cellulaires. Après le chargement, les cellules sont lavées avec HEPES solution saline tamponnée et conservés à 37 ° pendant encore 10 min. Avant de prendre une GQ-joint avec une électrode de pipette en verre, les cellules sont rincées 3 fois avec une solution tampon externe.
4. Un enregistrement cellule entière est alors établie à l'aide d'une solution sans colorant intracellulaire. Après 2-5 min d'enregistrement, le colorant est surtout retiré du neurone post-synaptique, permettant la visualisation de Fluo-4-chargés boutons synaptiques. Cette technique a été lancée par Ye et al ^5.
5. Les boutons de teinture chargés peuvent ensuite être visualisées en utilisant un grossissement élevé, élevé l'objectif d'ouverture numérique soit avec un microscope à base de caméra ou multiphotonique. Simultanée de cellules entières d'enregistrement et d'imagerie calcique peut être réalisé en utilisant une configuration comme indiqué dans la figure 3. Les images du neurone et les boutons de la figure 2C ont été capturés avec un dispositif électronique de charge en multipliant couplé (EMCCD) caméra. La puissance de la source de lumière pour l'excitation a été atténué à 1,2% avec une densité de 1,0 neutres filtre et un filtre d'iris ajusté à la sortie de 12%. Transitoires de calcium de l'boutons verts présynaptique peut être observée et enregistrée en temps réel, et mesuré hors ligne.

6. Les résultats représentatifs:

Spontanée et courant d'injection-évoqués des neurones Vibrodissociated

Enregistrements à partir d'un neurone typique vibrodissociated hippocampique CA1 pyramidale sont présentés dans la figure 4A. Spontanée de potentiels d'action dépassement peut être observé dans les neurones pyramidaux dissociée de rat basolatérale amygdale, l'hippocampe et VTA ^1,5. Lors de courant pince enregistrements de neurones CA1 pyramidale, hyperpolarisante injection de courant produit des réponses tension typique tandis que les courants de dépolarisation d'une ampleur suffisante susciter des potentiels d'action dépassement avec le motif de cuisson retardée typique avec des niveaux modérés actuels et potentiels d'action non-accommodante en réponse à l'injection de courant fort ( La figure 4B).

Spontanée et miniatures GABAergique inhibitrice courants postsynaptiques des neurones Vibrodissociated

Pendant voltage-clamp enregistrements avec une solution de CsCl à base intracellulaire, spontanée courants synaptiques sont observées (figure 5A). Ces événements sont éliminés en peu de calcium contenant une solution de ^2,6, et dans la plupart des types de neurones sont complètement bloqués par les antagonistes des récepteurs GABA _A, comme la bicuculline ou gabazine (figure 5B, C), indiquant que ce sont sIPSCs médiée par la libération du GABA et l'activation de ce sous-type de récepteur ionotropiques. Toutefois, dans les neurones principaux de régions du cerveau telles que l'amygdale basolatérale ² et l'aire tegmentale ventrale ^5,7, GABA _A blocage des récepteursrévèle de plus courte durée EPSCs médiée par l'activation glutamatergique de type AMPA récepteurs. Fait intéressant, l'application de TTX à des concentrations qui sont spécifiques à des blocus de plus sensible à la toxine canaux sodiques voltage-dépendants réduit la fréquence et l'amplitude de la sIPSCs observées dans les neurones du vibrodissociated plusieurs régions cérébrales (figure 6A) ^2,4,7. Ainsi, l'activité du canal sodique participe à la libération de GABA dans le pincé boutons-off synaptique. Il n'est pas encore clair si à part entière de potentiels d'action de sodium se produisent dans ces bornes. Il est à noter que la résistance d'entrée d'un puits scellé une terminaison axonale um de diamètre est susceptible d'être bien dans la gamme GQ. Ainsi, l'ouverture même d'un petit nombre de canaux de sodium pourrait être suffisant pour dépolariser terminaux pour activer les canaux calciques qui interviennent dans la sécrétion de couplage excitation. Sur le sujet de ces canaux calciques, les preuves suggèrent que N et P / Q-canaux de type participer à la libération des terminaux GABAergique dans les préparatifs du CA1 hippocampique vibrodissociated et ailleurs ^8.

La modulation et la plasticité de la transmission par un certain nombre de neurotransmetteurs et les récepteurs a été examinée en utilisant des neurones vibrodissociated ^3,4,9. Les neurotransmetteurs démontré qu'ils ont des actions modulatrices telles sont l'adénosine, GABA, sérotonine, les endocannabinoïdes, etc ^{2,6,10,11,12.} En outre, à court terme la plasticité synaptique, comme endocannabinoïde dépendante induit par la dépolarisation de suppression de l'inhibition (DSI) a également été décrite dans cette préparation ^2,11. Ces résultats indiquent que de nombreuses formes de médiée par le récepteur et trans-synaptique de signalisation par les neuromodulateurs endogènes sont intactes dans la préparation vibrodissociated.

Transitoires calciques et libération vésiculaire dans terminaisons axonales dans la préparation Vibrodissociated

En utilisant le microscope inversé équipé EMCCD décrit ci-dessus, nous avons examiné les transitoires de calcium dans les terminaisons présynaptiques des neurones dans le vibrodissociated-Bouton de préparation. La figure 2 montre de chargement cellulaire avec radio AM-estérifiés de dilution Fluo-4 et suivants de teinture postsynaptiques dans un hippocampe CA1 neurone pyramidal. Transitoires calciques spontanées sont observées dans certains boutons remplies de teinture montré que les régions d'intérêt (ROI) dans la figure 6B. L'application de 1 uM de tétrodotoxine (TTX) élimine ces transitoires spontanées, ce qui indique qu'ils sont médiés par l'activation des courants sodiques voltage-dépendants qui sont spontanément activé dans boutons, conduisant à des hausses de calcium ultérieures. L'augmentation de KCl extracellulaire de 10 mm à 40 mm avec échange de solution rapide augmentation de fluorescence produit tel que mesuré dans ROIs qui correspondent à des terminaisons présynaptiques (figure 7A). L'enregistrement simultané du neurone post-synaptique est utilisé pour surveiller sIPSCs et de déterminer si la fréquence des événements est augmentée par la dépolarisation high-K ⁺ (figure 7B).

Pour visualiser la fusion des vésicules dans les boutons présynaptiques nous avons utilisé des souris exprimant le synaptopHlourin construire sous le contrôle du promoteur Thy1 (étiqueté spH21 souris). SynaptopHluorin dans une construction moléculaire dans laquelle écliptique pHlourin (un mutant GFP avec sensibilité au pH améliorée) ¹² est liée à la protéine de la membrane des vésicules associées (VAMP2) ^13. Cet arrangement situe le motif pHlourin dans la lumière des vésicules où l'environnement relativement acide désaltère fluorescence. Après la fusion des vésicules de ce motif est exposé à l'environnement plus neutre extracellulaire avec une augmentation résultante de la fluorescence à lacrymaux qui correspondent aux vésicules / terminaisons présynaptiques. Vibrodissociation des neurones de l'hippocampe de souris permet spH21 pour la visualisation des points lacrymaux fluorescent de la taille et l'emplacement prévu pour les terminaux GABAergique (figure 8A). Application de la haute-K ⁺ - contenant une solution externe augmente la fluorescence dans ces bornes, et cet effet est bloquée en présence d'une solution externe dans lequel le calcium extracellulaire est réduite à 0,2 mM (figure 8B). Ainsi, l'augmentation induite par la dépolarisation de la fluorescence semble refléter l'excitation-sécrétion de couplage au niveau des synapses GABAergiques dans la préparation des neurones-Bouton.

La capacité de mesurer transitoires calciques présynaptiques et la fusion des vésicules de terminaisons axonales des neurones de la préparation-Bouton nous permet d'examiner les effets de neuromodulateurs, l'abus des drogues et la plasticité synaptique sur les mécanismes impliqués dans l'excitation présynaptique-sécrétion d'accouplement et l'exocytose / endocytose. Ces techniques peuvent aussi être combinés avec d'autres outils moléculaires et génétiquement des souris pour étudier le rôle des protéines spécifiques dans la fonction présynaptique et la modulation / plasticité.

Figure 1. Vibrodissociated neurones de la région CA1 hippocampique (A) image fusionnée de DIC uneND images de fluorescence verte d'une souris GAD65. L'image DIC est fusionné pour montrer clairement les emplacements des bornes verte (B) image de fluorescence à partir d'un synaptophluorin (spH21) de la souris. Barre d'échelle = 10 microns

Figure 2 Calcium indicateur de chargement procédure: (A) à cellules entières est chargé avec AM-estérifiés colorant; (B) de cellules entières d'enregistrement dilue colorant; (C) terminaux sont visualisés comme des régions d'intérêt (flèches)..

Figure 3. Schéma du montage expérimental pour une utilisation simultanée de cellules entières d'enregistrement et d'imagerie calcique dans les terminaux présynaptiques sur les neurones vibrodissociated. EMCCD = charge coupled device multipliant électrons.

Figure 4. Représentant courbes montrant (A) des potentiels d'action spontanés à partir d'un neurone vibrodissociated CA1 et (B) des réponses de tension et de membrane pour hyperpolarisante dépolarisants injections de courant dans le courant de serrage des enregistrements à partir d'un neurone CA1.

Figure 5 (A). Onde représentant du CISP spontanée d'un neurone CA1 pyramidale. (BC) Le CISP ont été bloqués par deux gabazine (10 uM; B) ou la bicuculline (20 uM; C).

Figure 6. TTX inhibe la transmission GABAergique spontanée synaptique, et élimine les transitoires calciques présynaptiques dans la préparation vibrodissociated hippocampe. (A) Enregistrement à partir d'un neurone vibrodissociated avant et pendant l'application de TTX. Notez la diminution de la fréquence et l'amplitude des sIPSCs. (B) transitoires calciques observées dans un terminal Fluo-4-chargés sur un neurone présynaptique vibrodissociated avant et pendant l'application de TTX. Notez la perte complète des transitoires.

Figure 7. Simultanée d'imagerie indicateur de calcium et sIPSC cellules entières d'enregistrement montrant les effets de K ⁺ grande stimulation. (A) Fluorescence mesurée au cours du temps à partir d'un bouton présynaptique chargé avec Fluo-quatre heures de teinture. (B) l'augmentation simultanée de la fréquence et l'amplitude au cours sIPSC haute K ⁺ application.

Figure 8. Ca ^{2 +-dépendante} de haute-K ⁺ réponse en boutons présynaptiques des neurones pyramidaux spH21 de la région CA1 hippocampique. (A) image de fluorescence d'un neurone vibrodissociated. (B) High-K ⁺ application (indiqué par une barre noire) a entraîné une augmentation soutenue de la fluorescence en présence de nos normale extracellulaire de Ca ^{2 +} solution contenant (2 mM de Ca 2 ^+). Pas d'augmentation de fluorescence a été observée à faible extracellulaire de Ca ^{2 +} (0,2 mM Ca ^{2 +).} Les données ont été normalisées dans le graphique de pré-haute-K ⁺ niveaux de fluorescence, et de montrer de réponse moyen de 3 boutons.

Discussion

Vibrodissociation réussie exige que les tranches contiennent neurones sains et que les espaces interstitiels sont suffisamment souples pour permettre aux neurones pour sortir de la tranche sans dégâts toxiques. Ainsi, la technique fonctionne de manière optimale au début âges postnataux (P1-21) lors des tranches saines peuvent être faites avec moins de matières gliales / interstiatial que se trouve dans des tranches de cerveau adulte. Dans notre expérience, cependant, l'optimisation de la préparation pour la tranche de la survie neuronale dans la tranche elle-même peut être contre-productif pour la technique vibrodissociation. Alors que nous avons l'habitude de préparer des tranches pour l'enregistrement in situ en utilisant froide aCSF modifié dans lequel le saccharose a été remplacé par une grande partie de la matrice extracellulaire ^de Na ⁺ et Ca ^{2 +,} les tranches préparées pour vibrodissociation peut être préparé (coupure par exemple) dans notre aCSF enregistrement normal. Lors de la préparation des tranches pour l'enregistrement à partir de neurones individuels dans les tranches elles-mêmes, nous aussi placer les tranches de aCSF normale à 35 ° C, juste après la coupe et les laisser pendant 30-60 min à cette température avant de les retourner à la température ambiante. Toutefois, les tranches sont préparées pour vibrodissociation déplacé immédiatement à la température ambiante, juste après le tranchage. Ces procédures fournissent un rendement plus élevé de neurones sains après vibrodissociation, peut-être à cause du manque de tissu interstitiel qui permet cabinet neurones pour être plus facilement détaché de son support de la tranche de lui-même. Nous n'avons pas examiné de manière exhaustive les conditions de préparation de tranches, comme nous avons l'habitude d'obtenir neurones suffisant pour notre enregistrement et des expériences d'imagerie sur un jour donné. Il est possible que des modifications supplémentaires, comme des changements dans l'épaisseur de coupe ou de procédures preincubaton, pourraient être apportées pour accroître le rendement des neurones sains. Très doux traitements protéase ont été essayées dans un effort pour augmenter le rendement des cellules et maîtriser la technique de travailler dans des animaux plus âgés. Toutefois, invariablement, même le traitement de la protéase douce semble pas perturber le fonctionnement des synapses. Ainsi, alors que la combinaison de la protéase et la dissociation mécanique peut encore être trouvée pour le travail qu'il n'a pas fait ses preuves dans les neurones du cerveau antérieur à ce jour.

Il convient également de noter le rendement relativement faible des neurones sains après vibrodissociation signifie que la technique est principalement utile pour étudier les sous-types neuronaux abondante, principalement les neurones de projection. La disponibilité des souris exprimant la GFP dans lequel de petites sous-populations neuronales peuvent être facilement identifiés augmente la chance d'étudier ces neurones plus rares. Cependant, à moins de rendement neuronale peut être sensiblement améliorée accumulation de données sur ces neurones est susceptible d'être relativement lente.

Plusieurs étapes se sont avérées cruciales pour le chargement réussi de neurones avec du calcium-sensing colorants. L'exposition aux PM-estérifiés teinture est réalisée à 37 ° C, et nous n'avons pas réussi à essayer de colorant de charge à basse température. La concentration des colorants devraient être optimisées considérant à la fois le temps de chargement et de la température car il semble que plus la concentration de colorant de chargement diminue la concentration de calcium dans les boutons présynaptiques. Nous avons observé que des concentrations plus élevées de chargement avec une diminution de la fréquence et l'amplitude de sIPSCs. Lors du chargement de calcium-sensing colorants dans les terminaux présynaptiques des neurones vibrodissociated, il faut prendre soin, car la capacité tampon de l'boutons petits présynaptique peut être différente de celle dans le soma et la taille des boutons ne sont pas compatibles. Neuron contenant les plats sont lavées avec tamponné HEPES solution externe suivants colorant de chargement, et le temps de récupération après le lavage est essentiel. En outre, pour faire une bonne étanchéité des cellules entières d'enregistrement, les cellules doivent être soigneusement lavés à se débarrasser de non internalisés molécules de colorant de la membrane cellulaire extérieure.

En plus d'utiliser des neurones vibrodissociated d'imagerie cellulaire électrophysiologie et en direct, des techniques immunocytochimiques peuvent également être appliquées à ces cellules ^11,12. Les cellules peuvent être facilement fixés et colorés avec une variété d'anticorps, et autres marqueurs cellulaires. L'utilisation de ces cellules permet une préparation propre pour la visualisation de l'expression des protéines dans les terminaisons présynaptiques GABAergique. En utilisant des souris qui expriment des protéines fluorescentes sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux neurones GABAergiques permet à l'enquêteur d'identifier individuellement terminaisons synaptiques dans la préparation de la vibrodissociated (figure 1). Marqueurs fluorescents imagerie de ce type peut permettre des mesures morphologiques dans les terminaux utilisant la microscopie à base de laser et de nouvelles techniques comme la STED (Microscopie épuisement stimulation d'émission). Visualisation avec des colorants que le rapport de vélo vésicules synaptiques est également possible avec cette préparation. Akaike et ses collègues ont qualifié terminaux GABAergiques avec le colorant styryle, FM1-43 pour visualiser les terminaux dans les cellules vivantes ^4.

Il devrait également être possible d'effectuer une seule cellule de la transcriptase inverse PCR pour l'ARN le profil d'expression dans vibrodissociatedneurones. Cette technique est couramment appliquée à enzymatiquement dissocié les neurones et les neurones en culture cellulaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item	Société	Catalogue #	Commentaires
Vibrant Slicer tissus	Leica Microsystems Inc	VT1200S
Boîte de culture cellulaire (35 mm)	BD Falcon	353001
Plats à fond de verre	Willco-vaisselle	GWSB-5040-3522 Ou GWSB	0.16 à 0.19 mm d'épaisseur de verre pour l'imagerie
Manipulateur piézoélectriques	Exfo-Burleigh	LSS-3000	Pourrait aussi utiliser le relais, etc
SD9 Place Pulse stimulateur	Technologies Herbe	SD9K	Pour le déclenchement manipulateur piézoélectriques
Dissection Stéréoscope	Wild Heerbrugg	TYP 374 590	Pourrait aussi utiliser n'importe quel stéréoscope
Flaming / Brown micropipette extracteur	Instrument Sutter	P-97
Paroi mince capillaires en verre	Instruments de précision du monde	TW-150F-4	Pour le verre scellées à la flamme micropipette et patch micropipette
Six systèmes de perfusion Canal Vanne de régulation	Warner Instruments	VC-6 ou VC-6M
Perfusion rapide Étape	Warner Instruments	SF-77B
Microscope inversé avec 20-63x objectifs	Nikon	TS200 Diaphot
Caméra EMCCD	ANDOR technologie	ixon EM + UA-888
Excite Source de lumière à éclairage par fluorescence	EXFO Solutions Photonics Inc	X-Cite 120PC
Fluo-4, AM indicateur de calcium	Molecular Probes	F14201