Modèle murin d'occlusion artère cérébrale moyenne

Résumé

Nous démontrons dans la vidéo un procédé pour produire une occlusion de l'artère cérébrale moyenne chez des souris adultes en utilisant un monofilament intraluminale. Nous montrons aussi comment évaluer l'étendue de l'infarctus cérébral par le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) coloration.

Résumé

L'AVC est la plus commune des maladies neurologiques mortelles aux Etats-Unis ^1. La majorité des accidents vasculaires cérébraux (88%) résulte d'un blocage des vaisseaux sanguins dans le cerveau (AVC ischémique) ^2. Comme la plupart des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (~ 80%) se produisent sur ​​le territoire de l'artère cérébrale moyenne (MCA) ^3, de nombreux modèles animaux AVC qui ont été développés ont porté sur cette artère. Le modèle monofilament intraluminale de l'artère cérébrale moyenne d'occlusion (MCAO) consiste en l'insertion d'un filament chirurgicale dans l'artère carotide externe et le filetage vers l'avant dans l'artère carotide interne (ACI) jusqu'à la pointe occulte l'origine de la MCA, ce qui entraîne une cessation du flux sanguin et l'infarctus cérébral ultérieur dans les ^quatre territoires du MCA. La technique peut être utilisée pour modéliser l'occlusion permanente ou transitoire ^5. Si la suture est enlevée après un certain intervalle (30 min, 1 h ou 2 h), la reperfusion est obtenue (transitoire MCAO); si le filament est laissé en place (24 h) la procédure est approprié comme un modèle de permanente MCAO . Cette technique ne nécessite pas craniectomie, une intervention neurochirurgicale pour enlever une partie du crâne, qui peuvent affecter la pression intracrânienne et de la température ^6. Elle est devenue la méthode la plus fréquemment utilisée pour imiter permanents et transitoires ischémie focale cérébrale chez les rats et les souris ^7,8. Afin d'évaluer l'étendue de l'infarctus cérébral, nous coloration des tranches de cerveau avec le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) pour identifier le tissu cérébral ischémique ^9. Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode MCAO et la détermination de la taille de l'infarctus par coloration TTC.

Protocole

1. Méthode MCAO

Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et des comités institutionnels Utiliser à l'UCSF et la Kent State University, et respecte les National Institutes of Health des lignes directrices pour l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Couper une suture monofilament 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) en 20 segments mm. Autour de la pointe de chaque segment en le chauffant près d'un cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Boston, MA). Mesurer le diamètre de la pointe à l'aide d'un micromètre (Applied Image Inc, Rochester, NY). Nous utilisons une suture avec un diamètre de l'extrémité finale de 0,21 à 0,22 mm pour une souris dont le poids corporel de 25-30 g.
2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage (minimum 121 ° C, 15 psi, pendant 15 min.) Désinfectez la table d'opération et des équipements associés à l'aide d'éthanol à 70%.
3. Anesthetize une semaine, âgé de 8 à 12 souris (25-30 g) avec 5% d'isoflurane (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) dans 30% d'O ₂ / 70% N ₂ O en utilisant le système V-10 d'anesthésie (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Après l'induction de l'anesthésie, de réduire le niveau de l'isoflurane et le maintenir à 1,5%.
4. Placez la souris dans la position couchée sur un coussin chauffant. Insérez une sonde rectale, et de surveiller et de maintenir la température corporelle de 36,5 à 37,5 ° C entre l'aide de la TR-200 du système de température homéothermes (Beaux-Sciences Tools Inc, Foster City, CA).
5. Rasez la fourrure sur la région du cou ventrale avec une tondeuse électrique (Braintree scientifique) afin d'exposer la peau. Désinfecter le site chirurgical en utilisant trois applications d'éthanol à 70%.
6. Sous un microscope stéréo dissection (Nikon, Japon), faire une longue incision de 1 cm sur la ligne médiane du cou. Utilisez écarteurs (Braintree scientifique) pour exposer le champ opératoire et d'identifier les artère carotide commune droite (CCA), artère carotide externe (CEA), et l'artère carotide interne (ACI). Soigneusement disséquer les artères entourant libre de nerfs et le fascia.
7. Disséquer le CEA encore distal et coaguler le CEA et son artère thyroïdienne supérieure (STA) branche en utilisant un coagulateur bipolaire (Howard Instrument Inc, Tuscaloosa, AL). Couper le CEA et STA au segment coagulé.
8. Librement lier deux 8-0 sutures de soie autour du moignon de la CEA. Appliquer une pince vasculaire (Outils Fine Science) à la bifurcation de la CCA dans le CEA et l'ICA.
9. Faire une petite incision à la fin de la CEA souche avec des ciseaux à ressort Vannas style (Outils Fine Science). Mesurer et noter la longueur d'une suture monofilament 5-0 arrondies à leur extrémité. Insérez le fil de suture dans l'incision et l'avance à la pince. Serrez les deux fils de soie autour de la lumière juste assez pour sécuriser tout en préservant la mobilité de la suture monofilament à demeure.
10. Retirez la pince de la bifurcation. Doucement avancer la suture de monofilament de la lumière de la CEA dans le ICA pour une distance de 9-10 mm au-delà de la bifurcation de l'ACC pour occlure l'origine de la MCA. La durée de la chirurgie est d'environ 30-45 min.
11. Suture de l'incision sur le cou et placez la souris dans une boîte de 35 ° C de soins infirmiers à se remettre de l'anesthésie, et le retourner à la cage. Il prend généralement 5-10 min pour les souris à se remettre de l'anesthésie. Pour effectuer MCAO transitoire, le chercheur peut re-anesthésier la souris et de retirer la suture de nouveau dans la souche de la CEA, après une période de temps, généralement entre 0.5 à 2 h.
12. Vingt-quatre heures après l'induction de la MCAO, anesthésier la souris avec 5% d'isoflurane et de l'euthanasier par dislocation cervicale. Décapitez la souris et de recueillir le cerveau. Trancher le cerveau coronaire en quatre tranches de 2 mm avec une matrice de cerveau (Braintree scientifique) sur la glace. Incuber les coupes de cerveau de 2% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) (Sigma-Aldrich) dans du PBS 1X pendant 20 min à température ambiante pour déterminer la taille et l'étendue de l'infarctus. Fixer les tranches de cerveau de 10% tamponné neutre solution de formol (Sigma-Aldrich) à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. L'étendue de l'infarctus peut être quantifiée comme décrit dans le protocole JoVE 955 ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) ^9.

2. Les résultats représentatifs

L'infarctus généré par MCAO sont vus dans le striatum et le cortex dorsolatéral. Le striatum est plus sensible à l'ischémie que le cortex cérébral. Trente minutes de MCAO va produire un infarctus que dans le striatum, tandis que plus d'une heure de MCAO va endommager à la fois le striatum et le cortex. Après 24 h MCAO permanente, le pourcentage d'infarctus totale est ~ 40 ± 5% de l'hémisphère et le taux de mortalité après chirurgie est ~ 10%. Nous excluons les souris à partir d'études supplémentaires si saignement excessif survient pendant la chirurgie, le temps de fonctionnement supérieur à 90 min, les souris ne parviennent pas à remettre de l'anesthésie dans les 15 min, ou une hémorragie se trouve dans les tranches de cerveau ou à la base du cercle de Willis lors de l'examen post-mortem .

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Images représentant la figure 1. Des tranches de cerveau TTC teinté (niveau coronal 1-4) après 24 h de MCAO permanente. Dans les tissus vivants TTC est enzymatiquement réduite par les déshydrogénases au 1,3,5-triphenylformazan (TPF), qui est de couleur rouge, tandis que dans les zones nécrotiques elle reste blanche en raison de l'absence d'activité enzymatique de type. Par conséquent, la zone de l'infarctus peut être identifié par sa couleur blanche en raison de l'absence de conversion de TTC de TPF. Remarque: TTC est un peu de chaleur et de lumière instables afin de protéger les coupes colorées de la chaleur et la lumière autant que possible.

Discussion

MCAO chez la souris est couramment utilisé pour le modèle d'ischémie cérébrale focale chez les humains. Utilisez la souris pour des études de course est devenue plus fréquente en raison de la disponibilité de souches transgéniques et knock-out. Il ya quelques détails essentiels à noter dans le protocole:

1. Il est essentiel de maintenir la température corporelle de souris pendant la chirurgie et avant qu'il récupère pleinement de l'anesthésie. La température corporelle a des effets sur l'étendue de l'infarctus; diminue l'hypothermie et d'hyperthermie augmente la taille de l'infarctus.
2. Alors que d'exposer et d'isoler le CCA et la CEA, d'éviter d'endommager le nerf pneumogastrique proximité et de la trachée, ce qui pourrait augmenter la taille de l'infarctus et la viabilité diminuer.
3. Ne jamais insérer le fil de suture monofilament plus de 10 mm passent de la bifurcation. Une suture inséré trop loin peut perforer l'artère cérébrale antérieure et entraîner des hémorragies cérébrales. Une résistance peut se faire sentir lorsque la suture est avancé environ 9-10 mm au-delà du point de bifurcation. Si cela se produit, le chercheur doit cesser d'avancer la suture et de confirmer la distance.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Chemical	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon Instruments	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011