La reconstitution in vitro de l'actif T. La télomérase castaneum

Résumé

Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d'une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l'isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum ( Tc TERT) et la reconstitution de la population active T. castaneum (RNP) complexes In vitro.

Résumé

Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d'une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l'isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum (Tc TERT) et la reconstitution de la T. actifs télomérase castaneum ribonucléoprotéines (RNP) complexes in vitro.

La télomérase est une transcriptase inverse spécialisée qui ajoute ^une répétition courts d'ADN, appelées télomères, à l'extrémité 3 'des chromosomes linéaires ² qui servent à les protéger de bout en bout de fusion et de dégradation. Après réplication de l'ADN, un court segment est perdu à l'extrémité du chromosome ^3, et sans télomérase, les cellules continuent divisant jusqu'à ce que finalement atteint leur limite de Hayflick ^4. De plus, la télomérase est en dormance dans la plupart des cellules somatiques ⁵ chez les adultes, mais elle est active dans ^six cellules cancéreuses où il favorise l'immortalité cellulaire ^7.

L'enzyme télomérase minimale se compose de deux éléments fondamentaux: la sous-unité protéique (TERT), qui comprend la sous-unité catalytique de l'enzyme et une composante intégrante ARN (TER), qui contient la TERT modèle utilise pour synthétiser les télomères ^8,9. Avant 2008, seules les structures pour les domaines télomérase individu avait été résolu ^10,11. Une percée majeure dans ce domaine est venu de la détermination de la structure cristalline des ¹² actifs, sous-unité catalytique de T. télomérase castaneum, Tc TERT ^1.

Ici, nous présentons les méthodes pour produire de grandes quantités de l'actif, Tc TERT solubles pour des études structurales et biochimiques, et la reconstitution du complexe RNP télomérase in vitro pour les tests d'activité télomérase. Un aperçu des méthodes expérimentales utilisées est montré dans la figure 1.

Protocole

1. L'expression de TERT recombinante Tc

1. Inoculer 6 L de 2YT médias (6 x 2 L Perplexe erlenmeyers contenant 1 litre de bouillon 2YT dans chaque) à partir de six plaques fraîches de cellules pLysS transformé Rosetta (DE3) contenant les synthétiques Tc TERT plasmide avec une TEV clivable N-terminale hexahistidine- tag.
2. Cultiver des cellules à 37 ° C tout en agitant à 220 rpm pour une DO ₆₀₀ de 0,5-0,6.
3. Induire l'expression de protéines en ajoutant 1 mM d'IPTG.
4. Réduire la température à 30 ° C, lent secouant à 150 rpm, et permettent aux cellules d'exprimer la protéine pour 4-5 h.
5. Récolte des cellules par centrifugation à 4 ° C et 3500 rpm pendant 30 min.
6. Resuspendre chaque cellule 1 L culot dans 20 ml de tampon contenant 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycérol, 0,5 M de KCl, 15 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoéthanol et 0,1 mM de fluorure de sulfonyle phénylméthyle (PMSF) et benzamidine.
7. Flash gel des remises en suspension le mélange de cellules par goutte lentement les cellules dans un tube conique de 50 ml en plastique rempli d'azote liquide, afin que chaque goutte se fige sur l'impact dans le liquide de N _2. Magasin de cellules congelées à -80 ° C jusqu'au moment de la purification des protéines.

2. Purification de Tc TERT

1. Cellules décongeler à température ambiante jusqu'à une consistance liquide est atteint, puis passer à des béchers de métal sur la glace pendant la sonication.
2. Soniquer cellules sur la glace pendant 2 min dans des intervalles de 30 secondes avec 30 secondes pauses, à environ 51 W de puissance.
3. Isoler les cellules lysées à 18 000 rpm pendant 20 min pour séparer les fractions protéiques solubles et insolubles et retirer délicatement le surnageant pour chromatographie d'affinité de nickel.
4. Equilibrer le Ni-NTA (nickel-acide nitrilotriacétique) colonne avec le tampon contenant 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycérol, 0,5 M de KCl, 15 imidazole mM, 5 mM β-mercaptoéthanol et 0,1 mM PMSF et benzamidine.
5. Charge surnageant sur la résine et de recueillir le flux à travers.
6. Laver la colonne avec le tampon contenant 25 mM Tris, pH 7,5, glycerol 10%, 500 mM de KCl, 15 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoéthanol et 0,1 mM de PMSF pour enlever toutes les protéines résiduelles et non spécifiquement lié.
7. Eluer Tc TERT de la résine Ni-NTA en utilisant un gradient d'imidazole de 15 - 300 mm et de recueillir des fractions de 3 ml pour l'analyse SDS-PAGE.
8. Utilisez analyse de page pour déterminer lequel des fractions contenant la protéine TERT Tc et concentrer ces fractions dans une Amicon 30 kDa (Millipore) filtre.
9. Concentré Tc fractions TERT à un volume inférieur à 10 ml d'une purification supplémentaire.
10. Le Tc TERT est purifié sur la colonne échangeuse de cations (SH Poros, Applied Biosystems) pré-équilibrée avec le tampon contenant 25 mM Tris, pH 7,5, glycerol 10%, 500 mM de KCl, et 1 mM de DTT.
11. Chargez le mélange de protéines sur la colonne HS Poros et le laver pour enlever tous les contaminants protéiques et d'acides nucléiques.
12. Laver la colonne avec le tampon contenant 500 mM de KCl suivie par 700 mM de KCl à éliminer tous les contaminants restants.
13. Eluer la protéine TERT Tc de la colonne Poros HS avec 1 M de KCl tampon. A ce stade la protéine devrait être plus que pur à 99%.
14. Retirez tout agrégats de protéines en passant la protéine sur une colonne Superdex-200 dimensionnement (chromatographie d'exclusion stérique - GE Healthcare), pré-équilibrée avec le tampon contenant 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycérol, KCl 500 mM, et 1 mM PTCE.

3. Coléoptère Tribolium castaneum la culture

1. Le T. castaneum coléoptères, où initialement prévu comme cadeau par le Dr S. Brown, Division de la Biologie, la Kansas State University.
2. Démarrer T. la culture castaneum en ajoutant cent coléoptères adultes dans un récipient avec 28,5 g de farine et 1,5 g de levure sèche de boulanger.
3. Magasin de cultures coléoptère à température ambiante et dans un endroit sombre, à l'environnement humide pendant trois à quatre semaines pour permettre la reproduction et la croissance. Placer un bécher contenant de l'eau dans la zone de stockage du dendroctone pour assurer un environnement humide.
4. Récolter les larves de coléoptères comme nécessaire pour l'isolement d'ARN. Autoriser les larves restant à maturité pour adultes, en les gardant dans la même culture.
5. Chaque mois, le transfert des coléoptères les plus actives (pas plus d'une centaine) dans un nouveau flacon contenant de la farine et la levure fraîche à renouveler leur approvisionnement alimentaire.

4. T. castaneum ARN total isolement

1. Larves de coléoptères récolte 20 à partir de la culture (chaque culture doit contenir entre 500 à 1000 larves) en les séparant des coléoptères adultes et de la culture de la farine / levure. Éliminer la farine ou des particules de levures attaché à la coléoptères avant de les moudre.
2. Stériliser la zone du banc, le mortier et le pilon (envisager de traiter les gants aussi) utilisé pour cette procédure avec RNaseZap (Ambion, Inc) pour enlever toute trace de ribonucléases avant le broyage des coléoptères.
3. Moudre les larves dans l'azote liquide ₂ en une fine poudre à l'aide d'un mortier et un pilon et transfert de la poudre dans un tube à centrifuger de 50 ml, tout en maintenant le liquide de N ₂ pour s'assurer que la poudre reste gelé jusqu'à ce que le tampon d'extraction est ajouté.
4. Autoriser l'excès de liquide N ₂ à s'évaporer de la poudre. Après que le liquide s'est évaporé N _2, d'homogénéiser la poudre ponderosa dans les 200 pi de tampon d'extraction (par 20 larves de coléoptères) contenant 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EGTA, 0,1 mM benzamidine, 200 mM de KCl, 10 % de glycérol, 10 mM d'imidazole et 20U de RNasin, pH 7,5, et incuber sur glace pendant 30 minutes.
5. Centrifuger l'homogénat à 15 000 rpm pendant 20 minutes à 4 ° C, de recueillir le surnageant et flash congeler l'échantillon dans un liquide de N _2. Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C la nuit.
6. Extrait de l'ARN total en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen).

5. Reconstitution in vitro de la télomérase castaneum Tribolium

1. Mélangez 20 mg de recombinaison TERT étiquette His Tc avec 50 ul de T. L'ARN total dans castaneum le tampon de liaison contenant 25 mM Tris-HCl, 200 mM de KCl, 10% glycérol, 5 mM β-mercaptoéthanol, et 10 mM imidazole, pH 7,5.
2. Incuber la TERT Tc - Total mélange ARN pendant deux heures à 22 ° C en T. lysat castaneum, en présence de l'inhibiteur de RNasine à prévenir la dégradation d'ARN.
3. Purifier le complexe sur une colonne Ni-NTA pour éliminer les impuretés et de l'ARN lysat excès.

6. Protocole d'amplification télomérase répétition (TRAP) des dosages

1. Mélanger 4 ug de Ni-NTA purifiée T. télomérase castaneum dans 50 ul contenant du tampon d'élongation à 20 mM Tris-HCl (pH - 8,3), 7,5 _mM MgCl2, 63 mM de KCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EGTA, 0,01% de BSA, 0,5 mM de dNTPs, 1 uM TCAS-TS amorce ADN (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), et incuber le mélange à 30 ° C pendant 60 minutes afin de permettre l'allongement de l'amorce d'ADN TCAS-TS par le reconstituée T. télomérase castaneum.
2. Extrait de la forme allongée ADN simple brin (ADNsb) en ajoutant un volume égal de phénol-chloroforme au mélange réactionnel. Agiter le mélange doucement jusqu'à ce que l'émulsion est homogène.
3. Centrifuger l'échantillon à 12000 rpm pendant cinq minutes à 4 ° C pour séparer les ADNss de contaminants.
4. Transfert de la couche aqueuse supérieure de l'échantillon dans un tube eppendorf de 1,5 ml; ajouter une concentration finale de 10 mM de NaOAc (pH 5,0), 1 mM de MgCl _2, et 66,4% EtOH et ensuite l'échantillon à précipiter nuit à -20 ° C.
5. Spin de l'échantillon à 15 000 rpm pendant trente minutes à 4 ° C pour culotter les ADNss précipité. Décanter la solution à l'aide d'une pipette, puis ajouter 200 ul d'EtOH à 70% de l'échantillon à laver reste NaOAc et MgCl ₂ de l'échantillon. Centrifuger l'échantillon pendant cinq minutes à la même vitesse et la température de re-granules de l'échantillon.
6. Décanter la solution EtOH aide d'une pipette et éliminer les traces restantes de l'éthanol en permettant au tube Eppendorf à incuber ouverte à température ambiante pendant trois minutes. Ayant éthanol présent dans l'échantillon va interférer avec l'étape d'amplification PCR.
7. Reprendre le culot ADNss (contenant le produit télomérase allongé et l'amorce du TCAS-TS) dans 50 pl de tampon de réaction PCR contenant 10 mM Tris-HCl (pH 8), KCl 50 mM, MgCl2 ₂ mM, dNTP 100 uM (dATP, dGTP et dTTP), 10 pM ^[32 P] dCTP, 1 uM TCAS-CX amorce (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') et 1,25 U de Taq ADN polymérase.
8. PCR amplifient les produits d'élongation télomérase (29 cycles de 94 ° C pendant 30 secondes, 50 ° C pendant 30 secondes, et 72 ° C pendant 1 minute), de sorte qu'ils sont visibles sur un gel de polyacrylamide 12%.
9. Pré-exécuter le gel de 12% avec Tris-Borate-EDTA (TBE) fonctionnant tampon contenant 44,5 mM de Tris, 44,5 mM d'acide borique, 1 mM EDTA, pH 8, pendant trente minutes avant l'exécution des exemples de PCR. Après le pré-course et le chargement du gel avec les réactions PCR, exécutez le gel à 185 volts pendant 1,5-2 heures à 4 ° Celsius ou sur la glace.
10. Sécher le gel et l'utilisation de la plaque de phosphore d'imagerie pour visualiser l'activité.

7. Les résultats représentatifs:

Un exemple de la TERT purifiée Tc après chromatographie d'exclusion stérique est montré dans la figure 2. La protéine concentrée après purification est exécutée sur un 12% gel SDS-polyacrylamide et se révèle être plus que pur à 99% (figure 2A). L'exclusion de taille (S200) chromatogramme est également fourni (figure 2B) pour démontrer la pureté et l'absence d'agrégats à partir de l'échantillon de protéine purifiée. Un rendement de 5 mg de protéine, après toutes les étapes de purification ont été réalisées est habituellement obtenue bien que le rendement final peut varier.

Un test TRAP représentant pour la reconstitution T. télomérase castaneum est montré dans la figure 3 comme indiqué précédemment par Mitchell et al. ^12. L'échelle progressive des produits de la télomérase peut être vu dans le couloir 1, toutefoisils sont absents dans les deux télomérase traité à la RNase et le TERT site actif mutante (D251A) échantillons dans les couloirs 2 et 3 respectivement.

Figure 1. Organigramme des étapes impliquées dans la reconstitution de la recombinaison de TERT Tc. Tout d'abord, le recombinant Tc TERT est sur-exprimé dans E. coli. La protéine est ensuite purifiée par le nickel, d'échange cationique, et la chromatographie d'exclusion stérique. Le T. coléoptères castaneum sont cultivées dans la maison et leurs larves sont utilisées pour isoler l'ARN total. Le Tc purifiée TERT et l'ARN total sont ensuite mélangés à reconstituer le complexe RNP télomérase, et un test TRAP subséquente est utilisée pour confirmer le complexe RNP est une télomérase active.

Figure 2. Chromatogramme d'exclusion de taille et de l'analyse SDS-PAGE de Tc TERT protéines. (A) 12% gel SDS-polyacrylamide de la protéine TERT Tc après chromatographie d'exclusion stérique. La protéine TERT Tc (70 kDa) migre plus rapidement sur ​​le gel SDS-PAGE, car il a un point isoélectrique élevé (pI - 9,8) (B). Chromatogramme d'exclusion de taille (Superdex S200) de la protéine TERT Tc.

Figure 3. Dosages piège de la reconstitués in vitro Tribolium castaneum télomérase adapté de Mitchell et al. ^12. Piste 1: type sauvage Tc TERT et l'ARN total isolé des larves de coléoptères. Ligne 2: type sauvage Tc TERT et traité à la RNase ARN total des larves et des extraits cellulaires. Voie 3: le site actif mutant Tc TERT (D251A) et de coléoptères ARN total de larves larves.

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Discussion

La méthode présentée ici permet de produire de grandes quantités de sous-unité catalytique de T. TERT télomérase castaneum sous forme soluble, actifs pour des études structurales et biochimiques. La méthode de Tc TERT sur-expression est sensible à des changements subtils dans la température ou la densité des cellules de ceux mentionnés ci-dessus et peut considérablement affecter les niveaux d'expression de protéines. Plus précisément, nous avons constaté que les cellules ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif	Société	Nombre de catalogue
Rosetta (DE3) Cellules plysS	Novagen	70956
2YT Bouillon	Teknova	Y0215
IPTG	Or la biotechnologie	I2481C
MISONIX Sonicator 3000	Qsonica, LLC.
ÄKTA Purificateur FPLC	GE Life Sciences
Résine Superflow Ni-NTA	Qiagen	30410
Amicon Ultra-15 dispositif centrifuge Filtre	Millipore	UFC903008
POROS 50 HS échange de cations forts d'emballage	Applied Biosystems	1-3359-06
POROS 50 HQ échange de cations forts d'emballage	Applied Biosystems	1-2559-06
Superdex 200 10/300 colonne d'exclusion de taille	GE Life Sciences	17-5175-01
Phénol: chloroforme: isoamyle 25:24:1 avec 10mm de Tris, pH 8, EDTA 1 mM	Sigma	P3803-100mL
RNaseZap	Ambion	AM9780
Recombinant inhibiteur de la ribonucléase Rnasin	Promega	N251B
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Oligonucléotides d'ADN	Integrated DNA Technologies