Immobilisation bactérienne pour l'imagerie par microscopie à force atomique

Résumé

En direct des bactéries Gram-négatives et gram-positif peut être immobilisé sur la gélatine-mica et imagée dans un liquide en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).

Résumé

L'AFM est une haute résolution (échelle nm) outil d'imagerie que les sondes mécanique d'une surface. Il a la capacité de cellules d'image et de biomolécules, dans un environnement liquide, sans la nécessité de traiter chimiquement l'échantillon. Afin d'atteindre cet objectif, l'échantillon doit suffisamment adhérer à la surface de montage afin de prévenir l'enlèvement par les forces exercées par la pointe de numérisation AFM. Dans de nombreux cas, l'imagerie succès dépend de l'immobilisation de l'échantillon à la surface de montage. Idéalement, l'immobilisation devrait être minimalement invasive à l'échantillon de telle sorte que les processus métaboliques et attributs fonctionnels ne sont pas compromises. En revêtement de surfaces mica fraîchement clivé par porcine (porc) de gélatine, les bactéries chargées négativement peuvent être immobilisés sur la surface et imagée dans le liquide par l'AFM. Immobilisation des bactéries sur la gélatine mica est très probablement due à l'interaction électrostatique entre les bactéries chargées négativement et la gélatine chargée positivement. Plusieurs facteurs peuvent interférer avec immobilisation bactérienne, y compris les constituants chimiques du liquide dans lequel les bactéries sont suspendues, le temps d'incubation de la bactérie sur les caractéristiques de gélatine mica recouvert de surface, de la souche bactérienne et le milieu dans lequel les bactéries sont imagés. Globalement, l'utilisation de gélatine-mica se trouve être généralement applicables pour l'imagerie des cellules microbiennes.

Protocole

1. Préparation de Mica:

1. Couper le mica (Sciences Electron Microscopy) avec des ciseaux à la taille nécessaire pour s'adapter au microscope AFM (env. 22 x 30 mm).
2. Enchaînement du mica, des deux côtés, généralement avec du ruban pour enlever la couche extérieure, jusqu'à ce que lisse couches ininterrompue demeurent.

2. Préparation de la solution de gélatine:

1. Ajouter 100 ml d'eau distillée à une bouteille de laboratoire.
2. Faire chauffer le biberon au micro-ondes jusqu'à ce que l'eau commence à bouillir. (Si un micro-ondes n'est pas disponible, l'eau peut être chauffée dans un bécher sur une plaque chaude.)
3. Peser 0,5 g de gélatine (Sigma G-6144, G-2625 ou G-2500) et ajouter à l'eau chaude distillée.
4. Agiter doucement le flacon jusqu'à ce que la gélatine soit complètement dissoute.
5. Refroidir la solution de gélatine à 60-70 ° C.
6. Verser environ 15 ml dans un petit bécher (20 ml) dans lequel le mica clivé coupées peuvent être trempés.

3. Mica revêtement:

1. Plonger les carrés de mica dans la solution chauffée de gélatine et de retirer rapidement de sorte que le mica est couché (fig. 1a).
2. Après le revêtement, le soutien du mica immédiatement, sur la pointe, sur une serviette en papier pour sécher à l'air ambiant (Fig. 1b). Le mica recouvert de gélatine peuvent être utilisés pendant au moins 2 semaines. L'excès de solution de gélatine peuvent être conservés au réfrigérateur et utilisé pendant environ un mois par un simple réchauffage de la solution stock à entre 60-70 ° C. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que la gélatine n'est pas bouillie pendant le réchauffage.

4. Montage des bactéries sur le mica recouvert de gélatine:

1. Pellet 1 ml d'une culture bactérienne (0,5 - 1,0 DO à 600 nm) de 800 à 4500 fcr. Selon les bactéries, l'utilisation du RCF minimum qui sera un culot cellulaire dans ~ 5 minutes.
2. Laver le culot dans le même volume d'eau déminéralisée filtrée ou un tampon.
3. Recueillir les cellules à nouveau par centrifugation.
4. Reprendre le culot rapidement dans 500 ul d'eau déminéralisée nanopure ou un tampon. (La suspension bactérienne doit être visiblement trouble afin d'avoir une concentration suffisante de cellules pour l'imagerie AFM).
5. Appliquer la suspension de cellules (10-20 uL) pour le mica recouvert de gélatine et la propagation sur la surface à l'aide d'une pipette (fig. 1c). Il faut prendre soin de ne pas toucher physiquement la surface de gélatine à la pointe de la pipette en appliquant ou la diffusion de la solution bactérienne.
6. Laisser la surface pour se reposer pendant 10 minutes et rincez avec un jet d'eau ou de tampon (figure 1 cd). Tout au long de la procédure, prendre soin de s'assurer que l'échantillon n'est pas autorisé à sec.

5. Les résultats représentatifs:

La figure 2 montre des images par exemple des cellules bactériennes qui ont été montés sur la gélatine-mica et imagée par l'AFM. Dans nos laboratoires, les échantillons sont généralement imagée en utilisant un microscope à force atomique PicoPlus (Agilent Technologies, le Temple, AZ) équipé d'une tête de balayage 100 um. L'instrument fonctionne à 128-512 pixels par ligne de balayage à une vitesse de balayage de 0,5-1,0 lignes / s. Les cantilevers qui sont typiquement utilisés sont des sondes Veeco nitrure de silicium (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) avec des constantes de printemps nominales allant de 0,01 à 0,1 nN / nm.

Figure 1. Gélatine à une température de 60-70 ° C est placé dans un bécher de 20 ml. En utilisant une paire de pinces de mica fraîchement clivées carrés sont totalement immergés dans la gélatine (a) retirée et placée debout sur une serviette en papier adossé à un support de micro centrifugeuse (b). Une goutte d'échantillon bactérien est mis sur le mica et étaler avec une pipette dans les deux directions X et Y (c). Après avoir laissé l'échantillon à incuber sur la surface du mica pour au moins 10 minutes, rincer l'échantillon dans un courant d'eau distillée. Si l'immobilisation a travaillé, vous serez capable de voir une tache opaque sur le mica comme indiqué dans le panneau de droite de (d). Si l'immobilisation n'a pas fonctionné, vous obtiendrez un morceau de mica clair que dans le panneau gauche. La tache opaque sur les échelles de mica à la concentration de la bactérie dans la gouttelette que vous placez sur le mica de gélatine traitée.

Figure 2. Images AFM de E. coli. Dans le graphique (a), les cellules sont montées sur la gélatine-mica et imagée de 0,005 M de PBS. A titre de comparaison, une image de cellules bactériennes monté sur la gélatine-mica et imagée dans l'air est montré dans le panneau (b). Bien septa sont clairement visibles dans l'image recueillie dans un liquide, une plus grande résolution, comme indiqué par la présence de pili (panneau en médaillon (b)), peut être obtenue dans l'air.

Discussion

Différents facteurs peuvent affecter la cellule microbienne de montage et d'imagerie par AFM. La gélatine qui est utilisée pour le revêtement du mica est important. Commerce de gélatine est isolé à partir d'un certain nombre de vertébrés, y compris les poissons, les vaches et les cochons. L'origine et la méthode de traitement de déterminer la pertinence de la gélatine pour immobilisation bactérienne. De nombreuses sources et les types de gélatine ont été évalués pour leur efficacité dans l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Société	Numéro de catalogue
Gélatine	Sigma, St. Louis, MO	G6144, G2625 G2500 ou
Microscope à Force Atomique PicoPlus	Agilent Technologies, Tempe, AZ
Cantilevers AFM	Veeco, Santa Barbara, Californie	MLCT-AUHW