Method Article
Cette étude décrit une méthode qui permet le diagnostic rapide et claire des maladies à virus des plantes en une demi-journée à l'aide d'une combinaison de micro-ondes usine de préparation d'échantillons assistée par microscopie électronique à transmission et les méthodes de coloration négative.
Les enquêtes sur les modifications ultrastructurales induites par les virus sont souvent nécessaires pour identifier clairement les maladies virales chez les plantes. Avec une préparation d'échantillon conventionnel pour microscopie électronique à transmission (MET) de telles enquêtes peut prendre plusieurs jours 1,2 et ne sont donc pas adapté pour un diagnostic rapide des maladies à virus des plantes. Fixation à micro-ondes peut être utilisé pour réduire considérablement le temps de préparation d'échantillons pour les enquêtes TEM avec des résultats similaires à ceux observés ultrastructurales après préparation des échantillons conventionnelle 3-5. Beaucoup de différents dispositifs sur mesure à micro-ondes faites sont actuellement disponibles qui peuvent être utilisés pour la fixation réussie et l'intégration des échantillons biologiques pour les enquêtes TEM 5-8. Dans cette étude, nous montrons sur le virus de la mosaïque du tabac (TMV) infecté plantes de Nicotiana tabacum qu'il est possible de diagnostiquer des altérations ultrastructurales dans les feuilles en une demi-journée à l'aide de la préparation des échantillons à micro-ondes assistée pour TEM. Nous avons choisi de réaliser cette étude avec un appareil à micro-ondes disponible dans le commerce car il effectue la préparation des échantillons presque entièrement automatiquement 5 à la différence des autres appareils disponibles, où de nombreuses étapes doivent encore être effectuées manuellement 6-8 et sont donc plus de temps et beaucoup de travail. En préparation de l'échantillon est effectuée de manière entièrement automatique coloration négative de particules virales dans la sève des autres TMV feuilles infectées et l'examen suivant de l'ultrastructure et la taille peut être effectuée lors de la fixation et l'inclusion.
Préparation de l'échantillon à micro-ondes assistée
2. Découper et de sectionnement
3. Coloration négative
4. L'analyse d'image
5. Les résultats représentatifs:
Après avoir assisté à micro-ondes de préparation des échantillons typiques TMV-induites modifications ultrastructurales tels que grandes surfaces contenant des virions alignés sous forme parallèle a pu être observée au microscope électronique à transmission dans le cytosol des personnes infectées Nicotianquelques cellules tabacum (figure 1A). En outre, dans la sève brute de TMV-infecté laisse particules TMV a pu être observé que flexueux, en forme de bâtonnets structures après coloration négative (figure 1B). Analyse de l'image de 100 particules virales ont révélé une taille moyenne de 280 nm pour TMV en longueur et en largeur 17Nm (figure 2). L'ultrastructure de cellules infectées par le TMV et la taille des virions observés dans cette étude ont été jugés en conformité avec TMV propriétés induites par le tabac et ultrastructurales dans la gamme de taille de particules TMV précédemment rapportés dans la littérature 9-15.
Figure 1. Micrographies électroniques à transmission de cellules infectées par le TMV feuilles et des virions. A) L'image montre l'ultrastructure des cellules infectées par le TMV feuilles mésophylle de Nicotiana tabacum après-ondes usine de préparation d'échantillons assistée. Notez la grande région de virions parallèles alignés qui se sont accumulés dans le cytosol.C = chloroplastique avec de l'amidon (St), M = mitochondrie, N = noyau, V = vacuole, Bar = 2 pm. B) L'image montre des virions qui ont été détectées par coloration négative dans la sève des feuilles infectées.
Figure 2. Taille relative des virions. Distribution relative de la longueur et la largeur de TMV-particules après coloration négative la sève des feuilles infectées telles qu'elles figuraient dans le microscope électronique. Les valeurs moyennes (moyenne longueur / largeur ± écart-type) ont été calculés à partir de 100 virions.
Micro-ondes préparation assistée échantillon de plante pour le TEM a été prouvé à fournir des données rapide et fiable ultrastructurales dans les quelques heures 3,4,16. La préservation structurale fine des organites et membranes obtenus avec la méthode utilisée dans cette étude était similaire aux échantillons conventionnels et cryofixed 5,15 avec l'avantage d'une réduction massive de la fixation de l'échantillon et l'incorporation de temps de 3 jours ou plus pour environ 2 heures. Cela représente le protocole le plus rapide de préparation des échantillons pour le TEM actuellement disponibles dans la littérature. La méthode décrite dans cette étude a combiné micro-ondes préparation assistée échantillon de plante pour le TEM aux méthodes de coloration négative qui a permis une identification claire et rapide de TMV-induites modifications ultrastructurales et l'agent viral lui-même. TMV modifications ultrastructurales induites pourraient être étudiés après la coupe, de sectionnement et de post-marquage pendant environ 4 heures après le début de la fixation de la transmission électron microscope. Utilisation de la manière entièrement automatique en mode de préparation des échantillons libéré le chercheur pour mener coloration négative dans l'intervalle afin de déterminer la taille et la largeur de l'agent viral. Ainsi, nous pouvons conclure que cette méthode permet un diagnostic clair et rapide des maladies à virus des plantes en une demi-journée qui est d'une grande importance pour une utilisation future dans des expériences agricoles et scientifiques des plantes phytopathologie. Comme cette méthode pourrait également être utilisée pour le diagnostic rapide des maladies animales et humaines qu'il a un grand potentiel pour des applications futures dans le domaine médical et de pathologie vétérinaire.
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Ce travail a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF, P20619 P22988 et à BZ).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif / équipement | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
Glutaraldéhyde | Agar Scientific Ltd | R1312 | |
Tétroxyde d'osmium | Agar Scientific Ltd | R1022 | |
100 agar résine | Agar Scientific Ltd | R1043 | |
L'anhydride dodécénylsuccinique | Agar Scientific Ltd | R1051 | |
L'anhydride méthyl nadique | Agar Scientific Ltd | R1081 | |
Benzyldiméthylamine | Agar Scientific Ltd | R1060 | |
Citrate de plomb | Agar Scientific Ltd | R1210 | |
L'acétate d'uranyle | Agar Scientific Ltd | R1260A | |
L'acide phosphotungstique | Agar Scientific Ltd | R1213 | |
Formvar | Agar Scientific Ltd | R1202 | |
Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Modèle plus récent est disponible | |
Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Modèle plus récent est disponible | |
Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
Philips CM10 TEM | FEI (anciennement Philips) | Modèle plus récent est disponible | |
La cellule D | Olympus Inc | ||
Optima 6.5.1 | Media Cybernetics Inc | Une version plus récente est disponible |
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