Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Résumé

Un modèle intéressant pour étudier différenciation des cellules souches au sein d'un animal vivant est le ver plat planaire. La régénération est étudiée par des expériences simples amputations qui sont facilement réalisées dans un laboratoire de base et sont susceptibles d'être (pharmacologiques et génétiques In vivo ARNi) de manipulation tel que détaillé par des protocoles dans cet article.

Résumé

Plathelminthes planaire libre-vivants ont une longue histoire d'utilisation en raison de leurs remarquables expérimentale capacités régénératrices ^1. De petits fragments excisés de ces animaux de réforme au plan du corps d'origine après la régénération des structures du corps manquant. Par exemple, si un fragment «tronc» est coupé à partir d'un ver intacts, «tête» d'une nouvelle va régénérer en avant et une «queue» se régénère arrière restaurer l'original de polarité «tête-à-queue» des structures du corps avant l'amputation (figure 1A).

La régénération est tirée par les cellules souches planaire, connu comme 'néoblastes »qui se différencient en ~ 30 différents types de cellules lors de l'homéostasie normale du corps et la régénération tissulaire appliquée. Ce processus de régénération est robuste et facile à démontrer. Grâce au dévouement de plusieurs laboratoires de pionnier, de nombreux outils et méthodes de génétique fonctionnelle ont été optimisés pour ce système modèle. Par conséquent, des progrès considérables ces dernières ont été réalisés dans la compréhension et la manipulation des événements moléculaires qui sous-tend planaire plasticité développementale ^2-9.

Le système modèle planaire sera d'intérêt pour un large éventail de scientifiques. Pour les neuroscientifiques, le modèle offre la possibilité d'étudier la régénération d'un système nerveux entier, plutôt que de simplement la repousse / réparation des cellules nerveuses du processus unique qui sont généralement l'objet d'études dans de nombreux modèles établis. Planaires exprimer une multitude de neurotransmetteurs ^10, représentent un système important pour étudier l'évolution du système nerveux central ^{11, 12} et ont un potentiel de dépistage comportementale ^{13, 14.}

Régénérative résultats se prêtent à la manipulation par apparoaches pharmacologiques et génétiques. Par exemple, les médicaments peuvent être criblés pour les effets sur la régénération, simplement en plaçant des fragments de corps à la drogue contenant des solutions à différents moments après l'amputation. Le rôle des gènes individuels peuvent être étudiés en utilisant des méthodes knockdown (ARNi in vivo), qui peut être atteint soit par des cycles de micro-injection ou par l'alimentation des bactéries-exprimé construit ARNdb ^{8, 9, 15.} Les deux approches peuvent produire des phénotypes visuellement frappant au-pénétrance de haute, par exemple, la régénération des animaux bipolaires ^16-21. Afin de faciliter l'adoption de ce modèle et l'application de telles méthodes, nous présentons dans cet article la vidéo protocoles pour les essais pharmacologiques et génétiques (ARNi in vivo par l'alimentation) en utilisant le Dugesia planaire japonica.

Protocole

1. Dosage de la régénération Tronc fragment

1. Arrêtez de nourrir une cohorte de vers au moins 5 jours avant le test de régénération pour assurer les animaux sont exempts de déchets et de la nourriture ingérée (~ 30 vers intacte, chaque ver ~ 8-10 mm de long après-faim).
2. Le jour du test, rincer un plat pré-gelé glace nivelé avec de l'eau et couvrir la surface plane glacé avec une pellicule de plastique. En utilisant des pinces, placer un papier filtre sur la pellicule de plastique.
3. Humidifier le papier filtre avec quelques gouttes d'eau de source. Transfert planaires sur le filtre (<20 vers par filtre) à l'aide d'une pipette de transfert. Les vers peuvent être repositionnées sur le filtre, si nécessaire, par repipetting avec de l'eau plus de ressort. Retirer l'excès de liquide.
4. Avec un scalpel, amputer la tête par une seule coupe faite à mi-chemin entre le sommet antérieur de l'animal et l'extrémité antérieure du pharynx (figure 1A).
5. Avec un scalpel, amputer la région de la queue par une coupe simple fait environ mi-chemin entre la queue de l'animal et l'extrémité postérieure du pharynx (figure 1A). Retirer l'excès de mucus sur l'utilisation du scalpel une serviette en papier humidifié avec de l'éthanol à 70% après la coupe. Essuyez l'excès d'éthanol à partir de scalpel.
6. Transfert filtre via une pince dans une boîte de Pétri (100 mm x 25 mm de profondeur) contenant de l'eau au printemps. Attendre environ 3 minutes (pour fermeture de la plaie, observables par un pincement et assombrissement de la plaie).
7. Rincez les fragments du tronc du papier filtre dans une boîte de Pétri contenant du milieu désiré pour l'essai de régénération et de transfert d'incubateur thermostaté (24 ° C).
8. Score phénotype régénératrice après ~ 1 semaine, lorsque les structures sont identifiables régénéré (figure 1A).

2. La manipulation pharmacologique de la régénération: bipolarité induite par le praziquantel

1. Préparer le praziquantel (PZQ) des stocks de médicaments par solubilisation dans le DMSO (62.4mg PZQ dans 1mL pour le stock 200mm). Utilisez le même jour.
2. Faire 50mL d'une solution contenant des médicaments (90 PZQ uM) en sels Montjuch tamponné. Vortex pour ~ 1 minute pour assurer une dispersion.
3. Effectuer test fragment de tronc de régénération tel que détaillé ci-dessus [le protocole n ° 1], exposant une cohorte de fragments de tronc pour PZQ à l'étape finale [1.7].
4. Après 24-48 heures, l'échange PZQ milieux contenant de l'eau au printemps, laver plusieurs vers (> 3) fois.
5. Retour vers l'incubateur. Score bipolarité (deux têtes, figure 1B) une semaine après la coupe.

3. La manipulation génétique de la régénération: dans le protocole in vivo d'alimentation ARNi

1. Avant de dosage, de préparer un homogénat de foie de poulet. Jeter gras, jaune sections colorées à partir Foodstock, et le foie de purée restante. Filtre de purée travers un tamis et une suspension pour le stockage aliquote (1,5 ml tubes, -20 ° C).
2. Avant de dosage, de préparer bovins globules rouges (hématies) par aliquotage approvisionnement en échantillons de 1 ml, conservés à -20 ° C.
3. Sélectionner des vers pour l'ARNi. Trois cohortes sont utilisés: le gène d'intérêt, le contrôle positif (gène avec l'ARNi phénotype est connu; figure 1C, D & E) de contrôle et de négatif (gène sans phénotype ARNi, également utile pour l'évaluation des niveaux de knockdown par rapport à la cohorte expérimentale). Pour chaque cohorte, l'utilisation des vers ~ 250 (~ 8-10 mm de long après avoir faim pendant au moins 5 jours). Conserver dans l'eau de source dans la baignoire en plastique.
4. Pour chaque action de cohorte ARNi dégel, de E. coli exprimant le gène d'intérêt ARNdb ciblant [8], avec un tube de l'homogénat de foie de volaille [3,1] et un tube de globules rouges [3,2].
5. Pellet bactéries (13 000 g, 1 minute). Retirer le surnageant et remettre le culot dans 2xYT médias (~ 700μl). Recentrifuger, éliminer le surnageant place, granulés sur la glace.
6. Créer un grand alésage P200 pointe de la pipette en coupant l'extrémité de la pointe. Bien resuspendre le culot bactérien dans un mélange de foie de volaille homogénat (150 pi) et les globules rouges (50 pi) de créer des ARNi mélange d'alimentation. Retirer les bulles d'air par centrifugation.
7. Pour l'alimentation, retirer la majorité de l'eau de la baignoire en plastique contenant des vers (laisser la profondeur ~ 1 pouce). Swirl baignoire pour se concentrer vers le centre de ce récipient, mélanger la pipette d'alimentation ARNi dans un cercle parcage vers. Utiliser une pipette de transfert soigneusement coaxial évadés en arrière sur le mélange d'alimentation sans perturber l'ARNi autres convives!
8. Après l'alimentation (~ 1 heure), identifier les planaires qui ont nourri bien. Ces vers montrent une coloration rouge profond d'érythrocytes ingérés. Jeter les autres.
9. Replacez soigneusement l'alimentation solution avec de l'eau de source fraîche, minimisant les perturbations pour empêcher egestion de nourriture. Pour ce faire, doucement localiser les vers d'un côté du tube à l'aide d'une pipette de transfert, versez l'eau trouble, et remplacer l'eau fraîche tombait le mur opposé de la baignoire. Planaires Resubmerge rapidement que l'exposition prolongée à l'air entraîne également egestion alimentaire.
10. Librement soicouvercle du récipient et retourner à al incubateur (24 ° C)
11. Répétez protocole d'alimentation ARNi sur plusieurs cycles (~ 2-3 jours d'intervalle), entrecoupées de cycles de régénération [protocole n ° 1] à l'écran des phénotypes ARNi. Un protocole standard pour l'alimentation et la régénération efficace pour de nombreux gènes est montré dans la figure 2, ce qui prend environ 1 mois dans la durée totale.

Modifier ce régime pour des gènes différents, comme le protocole optimal dépendra de facteurs tels que la stabilité des ARNm, localisation tissulaire, la perdurance de protéines, ou le développement d'un phénotype qui empêche les cycles d'alimentation multiple après régénération. Évaluer les niveaux knockdown simplement le dépistage de la pénétrance du phénotype (si apparente), ou par des approches qPCR pour comparer les niveaux d'ARNm ciblé avec la cohorte de contrôle négatif.

4. Les résultats représentatifs:

Le dosage de la régénération du tronc fragment est robuste tel que tous les vers doivent régénérer avec la normale antéro-postérieure («tête à la queue») de polarité. Ceci peut être obtenu dès que cinq jours après la coupe, facilitée par l'émergence de la ocelles antérieure (asterixed, figure 1A). Toutefois, la restauration complète des structures morphologiques perdus survient après une semaine. La manipulation pharmacologique de la régénération fragment de tronc par PZQ pour donner deux vers à tête (figure 1B) est aussi robuste (CE ₅₀ = 87 (+ -) fragments bipolaires 11%, 70μM PZQ pour 48 heures ^20). La bipolarité se produit sur un seul cycle de régénération. Moindre efficacité dans ces essais concerne vraisemblablement des problèmes avec la solubilité des médicaments et / ou le stockage ou l'utilisation d'une espèce différente, où plathelminthes PZQ est inefficace. Pour les médicaments à faible pénétrance, un indice anteriorization est souvent utilisé pour marquer phénotypes intermédiaires côté de ²² bipolarité complète. Phénotypes résultant de l'ARNi des constructions de contrôle positifs sont présentés dans la figure 1: l'ARNi des Dugesia japonica six 1 (D j-six-1) se traduit par un phénotype eyeless ²³ (figure 1C), d'ARNi Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) en résulte une perte de la réponse aversion pour la lumière ²⁴ (figure 1D) et des ARNi Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) se traduit par un phénotype bicéphale ^{16-19, 21} à partir de fragments du tronc (figure 1E). Ces phénotypes peuvent être obtenus en utilisant les protocoles simples suivantes ARNi: Dj-six-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), où F = cycle d'alimentation et x = cycle de régénération, respectivement.

Figure 1:... Test de régénération Tronc fragment A gauche, image de la planaire (en haut) et le schéma (au milieu) pour indiquer l'emplacement du fragment du tronc excisée Droite, timecourse de régénération fragment de tronc montrant l'aspect du fragment régénérant aux temps indiqués (jours) B Image de deux têtes planaire produite par l'exposition PZQ. C 'Eyeless «ver produite par Dj-six-1 ARNi. Perte de la réponse de l'aversion D de lumière dans les vers immobiles Dj-PC2 ARNi (coloré en rouge), comparé à un ver de contrôle mobile (tachés vert). E bipolaire planaire produit par Dj-βcatenin-1 ARNi. En BE, la fin originale antérieure du ver ARNi est orientée vers la gauche.

Figure 2: Séquence d'alimentation et de coupe pour les cycles de RNAi protocole typique comprenant plusieurs tétées (F), et les cycles de régénération (x) qui est efficace pour abattre de nombreux gènes dans D. japonica. La modification de ce protocole pour les gènes individuels peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux, par exemple en utilisant un. Moindre (entre parenthèses) ou un plus grand nombre de cycles d'alimentation et de régénération

Discussion

Les protocoles décrits ici en détail des essais pour étudier et manipuler la régénération de la planaire Dugesia japonica. Elles sont simples et ne nécessitent pas de matériel spécialisé tel qu'ils peuvent être facilement réalisées en laboratoire ou en classe. Les dosages peuvent être effectués individuellement ou combinés (pour le dépistage génétique des produits chimiques des efficacités médicament in vivo) et peut être effectuée au niveau du gène candidat, ou sont adaptables à impartiales, dépistage du débit plus élevé ^8. Que ce soit pour étudier la biologie fascinante des Planaires dans leur propre droit, ou pour évaluer la fonction in vivo des homologues de mammifères dans un modèle alternatif pour l'étude de la régénération des tissus, ces approches devraient catalyser l'intérêt d'un large éventail de chercheurs.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs	Vendeur	Numéro de catalogue	Commentaires
L'eau de source	Kandiyohi. Prime Waters Inc Minneapolis, MN	n / a	D'autres formes d'eau de source bien travailler aussi. Premier essai dans des essais de viabilité.
1 x tampon sels Montjuïch: NaCl (1.6mm), CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0,1 mm), KCl (0,1 mm), NaHCO3 (1.2mm), HEPES (1,5 mm). pH 7,4 à 24 ° C.	Plusieurs fournisseurs	n / a	D'eau artificielle pour les traitements médicamenteux au cours des essais de régénération pour assurer tamponnage du pH. Solution de 5 / 8 Holtfreter est une alternative.
2xYT Bouillon	Fisher Scientific	BP2467-500	Médias = 31 g / L. Autoclavés.
Boîte de Pétri (100x25mm)	Fisher Scientific	08-757-11	Vers le logement pendant les cycles de régénération
Plat carré (100x100x15mm)	Fisher Scientific	08 à 757-11A	Remplissez avec de l'eau, du gel pour le bac de glace utilisée comme surface de coupe ver
Baignoire en plastique: n Twist Ziploc »Loc (16 oz).	Divers détaillants	n / a	Récipients d'eau pour les cohortes serrées Pratique ARNi
Foie de poulet	Épiceries commerciaux	n / a	Biais vers des approvisionnements organiques, en raison de l'évitement d'antibiotiques.
Mélangeur à main	Tout fournisseur de cuisine	n / a	Utilisez pour faire la purée de foie de volaille
Fil 1mm mailles	Tout fournisseur de cuisine	n / a	Utilisez pour tamiser la purée de foie de volaille
Bovine globules rouges	Lampire laboratoires biologiques	7240807	100% lavé et mis en commun la suspension de RBC
Circulaire papiers filtres	Whatman n ° 3	1003 055
Pipette de transfert	Fisher Scientific	13-711-41
Stériles, les lames chirurgicales	Plusieurs fournisseurs	n / a
± Praziquantel	Sigma-Aldrich	P4668	Aliquotes Conserver la poudre dans l'obscurité à 4 ° C. Dessécher.
Dj-six-1		GenBank AJ557022.1	ARNi contrôle positif de "eye-moins" 23 phénotype
Dj-βcatenin-1		GenBank AB181913.1	ARNi contrôle positif de deux têtes phénotype 17
Dj-PC2			ARNi contrôle positif pour la perte de l'aversion au phénotype lumière 24