Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Résumé

Malgré les progrès récents dans la modification génétique, la transfection de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) reste un processus capricieux. A notre connaissance, les méthodes systématiques et efficaces pour transfecter l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) n'ont pas été signalés. Ici, nous décrivons les protocoles robustes pour transfecter efficacement et nucleofect iPSCs de l'homme.

Résumé

La modification génétique continue d'être un outil essentiel dans l'étude de la biologie des cellules souches et en énonçant des applications cliniques potentielles des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ^1. Bien que des améliorations dans plusieurs méthodes de transfert de gènes ont été décrits ^2-9, transfection reste un processus capricieux de CSEh, et ​​n'a pas encore été signalé dans l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP). Dans cette vidéo, nous démontrons comment notre laboratoire transfecte régulièrement et nucleofects iPSCs de l'homme en utilisant le plasmide avec une protéine de fluorescence verte renforcée (eGFP) journaliste. IPSCs de l'homme sont adaptés et entretenus de manière alimentation sans cultures afin d'éliminer la possibilité de transfection de cellules nourricières et de permettre une sélection efficace des clones stables iPSC transgéniques après transfection. Pour nucléofection, iPSCs de l'homme sont pré-traités avec un inhibiteur ROCK ^11, trypsinisées en petits amas de cellules, nucleofected et réensemencées sur les départs dans le chargeur conditionné par les cellulesmoyen d'améliorer la récupération des cellules. Transgène exprimant iPSCs de l'homme peut être obtenu après 6 heures. Sélection antibiotique est appliqué après 24 heures et stables lignées transgéniques apparaître dans 1 semaine. Notre protocole est robuste et reproductible pour des lignées iPSC sans altérer la pluripotence de ces cellules.

Protocole

Notre protocole débute avec une méthode d'adaptation de l'homme aux cultures iPSCs chargeur-libres, suivies de protocoles pour la transfection iPSCs humains en utilisant GeneJuice (EMD) et nucléofection de iPSCs humains en utilisant un dispositif AMAXA nuclefector.

Remarque: Les procédures suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. Tous les milieux et solutions sont équilibrées à 37 ° C ou à la température ambiante avant de commencer, sauf indication contraire.

1. Établir iPSCs de l'homme sur le départ sans système

IPSCs homme auparavant maintenus sur des cellules nourricières peuvent être divisés, transféré sur Geltrex enduit plat et maintenu pendant deux passages avant d'alimentation sans transfection.

1. Décongeler Geltrex nuit à 4 ° C. Pour préparer revêtement Geltrex, diluer décongelé Geltrex 1:50 dans du DMEM froid. Mélanger les solutions en douceur.

Remarque: Geltrex, comme Matrigel est une forme soluble de matr membrane basaleix purifiées à partir de souris Engelbreth-Holm-Swarm cellules tumorales (EHS). En variante, le Matrigel peut être utilisé comme une matrice extracellulaire pour établir des liaisons de cultures libres homme IPSC.

2. Couvrir toute la surface du puits de culture avec Geltrex solution (1 ml pour un 35-mm également). Manteau puits avec Geltrex à 37 ° C incubateur pendant 1 heure.
3. Pour iPSCs passage de l'homme, ajouter 1 ml de Accutase par puits et incuber à 37 ° C pendant 1 min jusqu'à ce que la plupart des cellules commencent à se détacher.

Pour iPSCs passage de l'homme, ajouter 1 ml de Accutase par puits et incuber à 37 ° C pendant 1 min jusqu'à ce que la plupart des cellules commencent à se détacher.

4. Ajouter 10-15 perles de verre aux cellules et mélanger doucement en tournant la plaque. Ajouter 2 ml de DMEM KnockOut / F12 et doucement triturer. Transfert suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 10 ml.
5. Spin cellules à 800 rpm pendant 3 min à température ambiante.
6. Aspirer le surnageant à partir du tube, en laissant intact l'homme iPSC culot. Tapotez doucement le tube àdisperser culot cellulaire.
7. Retirer Geltrex du bien enrobées.
8. Resuspendre doucement humaine iPSC culot dans un volume approprié de STEMPRO. Distribuer entre les puits de dispositifs d'alimentation, en fonction du taux de prolifération). CSPi humaines peuvent être repiquées dans un rapport de division de 1:2 à 1:6.
9. Placer soigneusement dans 5% de CO ₂ incubateur, tourbillon avec précaution la plaque pour assurer une distribution uniforme de cellules à travers le puits.
10. Cellules Flux jour jusqu'à ce que les cellules sont prêts à être divisé de nouveau (quand les cellules atteignent 80% de confluence).
11. CSPi passage de l'homme sur Geltrex nouveau puits revêtu de l'étape (1,3 à 1,9) dans un rapport de division de 1:2. Les petites colonies doit être formé et réparti uniformément sur Geltrex enduit bien avant la transfection.

2. La transfection de iPSCs de l'homme avec GeneJuice

(Cellules cultivées sur des plaques de 6 puits) doit être d'environ 40 -50% de confluence le jour de la transfection d'atteindre une efficacité de transfection optimale. Il estpas nécessaire de modifier le milieu cellulaire jusqu'au lendemain.

1. Préparer 100 KO-DMEM/F12 ul dans un tube stérile de 1,5 ml Eppendorf. Ajouter 27 ul de réactif de transfection GeneJuice. Mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
2. Ajouter 4 ug d'ADN plasmidique. Incuber le tube à température ambiante pendant 15 minutes. Le choix du plasmide est essentiel pour l'efficacité de transfection optimale. Nous utilisons un plasmide avec une protéine de fluorescence verte renforcée (eGFP) entraînée par l'ACG promoteur ⁵ (pCAG-eGFP). CAG promoteur est un promoteur fort qui est transcriptionnellement actif dans iPSCs de l'homme et peut donc être utilisé pour diriger l'expression du transgène dans ces cellules. Dans nos mains, la linéarisation du plasmide ne semble pas affecter l'efficacité de la transfection.
3. Ajouter GeneJuice ADN-mélange pour les cellules et les remous de la plaque. Faites tourner la plaque à 1200 rpm pendant 5 minutes (méthode «spinoculation ') pour augmenter le contact du mélange de transfection avec iPSCs de l'homme sur le bien.
4. Incuber les cellules à 37 ans ° C durant la nuit.
5. Surveiller l'efficacité de transfection le lendemain.
6. Pour la transfection stable, changer moyenne le lendemain avec STEMPRO frais. Ajouter le choix des antibiotiques après 24 - 48 heures.

3. Nucléofection de l'homme iPSCs

IPSCs humaines cultivées sur les départs ou Geltrex peut être utilisé pour nucléofection. Cependant, nous recommandons fortement replacage nucleofected iPSCs de l'homme sur fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) ou des fibroblastes de prépuce humain (HFF) mangeoires pour assurer la viabilité cellulaire élevée et la récupération. Au moins 2 millions de cellules doivent être utilisées pour obtenir la survie de cellules plus élevée à la suite nucléofection.

1. Préparer chargeur à pile milieux conditionnés (CM) en incubant humaine KnockOut iPSC sériques de rechange (KOSR) des médias avec des cellules nourricières du jour au lendemain. Recueillir CM toutes les 24 heures.

Remarque: Toute souche de souris utilisée pour la préparation de couches de connexion (tels que BLK6, CF1 et MF1) est adapté pour être utilisé for faire CM.

2. Le jour de nucléofection, pré-traiter iPSCs de l'homme avec 10 inhibiteur de ROCK uM pendant au moins 1 heure.
3. Préparer 82 ul de solution-mère Nucleofector de cellules humaines dans un tube stérile de 1,5 ml Eppendorf. Ajouter 18 ul supplément 1. Mélangez bien. Incuber la solution à 37 ° C pendant 5 min.
4. Pré-chargeur réchauffer la pile milieu conditionné (CM) et 0,25% de trypsine / EDTA à 37 ° C. Sous le capot, prelabel une stérile 15 ml tube conique.
5. Retirez délicatement les médias de la culture iPSC humaine à nucleofected. Lavez délicatement les cellules avec 2 ml de solution de phosphate 1X tamponnée (PBS) par puits. Aspirer le PBS. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,25% par puits. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 3 min.
6. Doucement triturer les cellules avec 1000 ml de pointe de pipette. Laver le fond du puits pour s'assurer que tous iPSCs de l'homme sont complètement détachés. Transfert suspension cellulaire à l'étiquette tube de 15 ml conique.

Remarque: la trypsine en simple caunes devraient être strictement évités. Les cellules doivent être délogé en petits amas de cellules se composait d'environ triplets de cellules. Petits amas de cellules (cellules triples) seront dissociées en cellules isolées au cours de la manipulation ultérieure des cellules.

7. Ajouter 9 ml de milieu MEF pour inactiver la trypsine. Spin cellules à 800 rpm pendant 3 minutes. Aspirer soigneusement le surnageant et laisser le culot de cellules intactes.
8. Remettre en suspension les cellules dans préchauffé 100 pl de solution cellules souches humaines Nucleofector de l'étape 3.3.
9. Transfert de cellules dans une cuvette Nucleofector l'aide d'une pipette de 1 ml.
10. Ajouter 4 ug d'ADN plasmidique dans la suspension cellulaire dans la cuvette. Mélanger les cellules et l'ADN en remuant doucement. Appuyez sur la cuvette deux fois sur la surface de la hotte.
11. Insérez la cuve dans le porte-Nucleofector. Utiliser les programmes B-016. Cellules Nucleofect en appuyant sur le bouton X.

< > S'affiche lorsque le processus est complet nucléofectioned (ne prend généralement que 1-5 secondes). L'utilisation de programmes nucléofection autres (A-023, 033-A et U-023) a abouti à moins de 10% de cellules positives eGFP de CSPi humaines.

12. Récupérer les cellules nucleofected de la cuvette avec la condition Pasteur en plastique pipette. Récupérer les cellules en les remettant en suspension dans CM préchauffé et un inhibiteur de ROCK dans un tube stérile de 1,5 ml Eppendorf. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 minutes pour laisser les cellules récupérer.
13. Cellules de transfert de goutte à goutte sur des couches nourricières en utilisant 1 ml de pointe de pipette. Incuber les cellules à 37 ° C pendant la nuit.
14. Surveiller l'efficacité de transfection le lendemain. Pour obtenir des clones stables de iPSCs transgéniques exprimant de façon stable l'homme qui transgène, changer moyenne le lendemain avec CM et un inhibiteur de ROCK. Ajouter le choix des antibiotiques après 24 - 48 heures.

4. Les résultats représentatifs:

Figure 1. photomicrographies de Riv1 iPSCs humaines transfectées avec pCAG-eGFP. (A) eGFP exprimant Riv1 cellules transfectées en utilisant GeneJuice sur Geltrex 12 heures après la transfection. Les colonies de Riv1 iPSCs homme plaqué et formé sur les départs suivants nucléofection l'aide de B-016 (B) et A-023 (C) du programme. (D) de manière stable exprimant eGFP-colonies humaines iPSC avec une expression ubiquitaire eGFP dérivé de GeneJuice. (E) stablement transfectées Riv1 iPSCs humains conservés expression constitutive eGFP cours de la différenciation corps embryoïdes.

Discussion

Notre résultat protocoles techniques simples, robustes et hautement reproductible à introduire des transgènes dans iPSCs homme sans effet toxique important et la mort cellulaire. IPSCs de l'homme doivent être repiquées en petits amas de cellules (cellules 5-10) et étalées sur Geltrex à haute densité (1:2) pour assurer l'efficacité de transfection optimale dans de nombreuses petites colonies. Pour l'homme iPSC lignes qui sont plus sujettes à la mort cellulaire et la différenciation, plus grand nombre de iPSCs de l'homme (jusqu'à 4 x 10 ⁶ cellules) doit être utilisé pour une expérience unique nucléofection. Analyse de transfection transitoire génère un grand nombre de transgènes exprimant iPSCs de l'homme au sein de 1 jour. Transfectées de façon stable clones iPSC apparaissent habituellement dans les 7 jours, et ces colonies transgéniques doivent être prêts à être cueillis dans les trois semaines. L'utilisation d'un promoteur CAG décrit ici assure expression ubiquitaire de rapporteur de l'EGFP. En vertu de ces améliorations, nos protocoles peuvent être introduits dans d'autres applications, y compris la surexpression, conditionnel induction, des lignées reporter lignée spécifiques, ou shRNA knockdown siARN, la recombinaison homologue et ciblage génique.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25% de trypsine avec de l'EDTA	Invitrogen	25200056
2-mercaptoéthanol	Invitrogen	21985-023
3 billes de verre mm	Fisher Scientific	11-312A	Perles de verre doivent être lavés avec de l'acide chlorhydrique (HCl) pendant une nuit, rincé avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH) et de l'eau distillée, et stérilisé à l'autoclave avant l'utilisation.
Cellule Accutase dissociation réactif	Invitrogen	A11105-01
Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF)	Invitrogen	PHG0263
DMEM (glycémie élevée)	Lonza	12-741 F
Sérum de veau foetal	Invitrogen	16000044
Geltrex	Invitrogen	12760013	Facteur de croissance réduite
Réactif de transfection GeneJuice	EMD Biosciences	70967
Glutamax-I (100X)	Invitrogen	35050061	L-glutamine (Invitrogen, 25030081) peut également être utilisé à la place.
Human iPSC KOSR médias			500 ml humaine ES médias se compose de 390 KnockOut ml de DMEM / F12, 100 ml Sérum Replacer KnockOut, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 pi 2-mercaptoéthanol (55mm) et additionné de 10 ng / ml de bFGF .
KnockOut DMEM/F12	Invitrogen	12660-012
Remplacement KnockOut Serum (KOSR)	Invitrogen	10828-028
Médias de fibroblastes de souris embryonnaires			MEF médias se compose de 90% de FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I et du pyruvate de sodium dans du DMEM 1X (glycémie élevée)
Acide aminé non essentiel, NEAA? (100X)	Invitrogen	11140050
Les cellules souches humaines Nucleofector solution à 1 avec supplément	Lonza	VAPH-5012
Phosphate Buffered Saline sans Ca 2 + et Mg 2 +	Invitrogen	10010023
Pyruvate de sodium (100X)	Invitrogen	11360070
STEMPRO support kit	Invitrogen	A1000701	500 ml STEMPRO médias se compose de 454 ml de KnockSur DMEM / F12, 10 ml STEMPRO supplément de croissance sans sérum (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml de BSA (albumine de sérum bovin, 25%), 909 ul 2-mercaptoéthanol (55mm ) et additionné de 10 ng / ml de bFGF.