Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Résumé

Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux pour In vivo Les études chez l'animal. Nous décrivons comment rAAVs peuvent être produites dans le laboratoire et la manière dont ces vecteurs peuvent être titrés de donner une lecture précise du nombre de particules infectieuses produites.

Résumé

Ces dernières années, adéno-associé recombinant vecteurs viraux (AAV) sont devenus de plus en plus précieux pour les études in vivo chez l'animal, et sont également actuellement testé dans des essais cliniques humains. AAV de type sauvage est un membre non-pathogène de la famille des Parvoviridae et intrinsèquement réplication déficiente. Le profil de transduction large, faible réponse immunitaire ainsi que l'expression du transgène forte et persistante obtenus avec ces vecteurs en a fait un outil populaire et versatile pour in vitro et in vivo de gènes. rAAVs peut être facilement et à moindre coût fabriqués en laboratoire et, en fonction de leur profil d'innocuité favorable, sont généralement donnés une classification de sécurité faible. Ici, nous décrivons une méthode pour la production et du titrage rAAVs chimérique contenant les protéines de capside des deux AAV1 et AAV2. L'utilisation de ces vecteurs dits chimérique combine les avantages des deux sérotypes parentale tels que les stocks de titres élevés (AAV1) et de la purificationpar chromatographie d'affinité (AAV2). Ces sérotypes d'AAV sont les mieux étudiés de tous les sérotypes AAV, et individuellement ont un modèle d'infectivité large. Les vecteurs chimériques décrites ici doivent avoir les propriétés infectieuses de AAV1 et AAV2 et peut donc s'attendre à infecter une large gamme de tissus, y compris les neurones, les muscles squelettiques, le pancréas, du rein, entre autres. La méthode décrite ici utilise purification sur colonne d'héparine, une méthode cru donner un titre plus élevé virale et plus propre que les méthodes de préparation virale de purification d'autres, comme la centrifugation à travers un gradient de chlorure de césium. De plus, nous décrivons comment ces vecteurs peuvent être rapidement et facilement titrés de donner une lecture précise du nombre de particules infectieuses produites.

Protocole

Voir Figure 1 pour une illustration résumant le protocole suivant.

Note de sécurité: Tous les documents qui ont été en contact avec les particules virales assemblées doit être désinfecté avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié.

1. Préparation des stocks d'ADN plasmidique (~ 2 jours)

1. Les plasmides suivants sont requis ^1:
   • pRV1 - Contenant de la Rep AAV2 et des séquences Cap
   • PH21 - Contenant de la Rep AAV1 et des séquences Cap
   • pFdelta6 - Adenovirus-plasmide helper
   • Plasmide AAV contenant la cassette d'expression recombinante flanqué AAV2 signaux d'emballage (répétitions terminales inversées, RTI)
2. Bien pFdelta6 doivent être cultivées dans Stbl2 cellules compétentes pour empêcher la suppression partielle, pRV1 et PH21 peuvent être cultivés dans des cellules DH5alpha compétentes. Plasmides AAV peuvent être cultivés dans des cellules Stbl2 si délétions partielles se produisent dans les cellules DH5alpha.
3. L'ADN plasmidique devrait être de haute qualité et exempts de contaminants ARN. Les plasmides peuvent être sélectionnés pour l'intégrité en utilisant les suivantes digère:
   • pRV1 - digérer par Xbal pour donner des bandes de 7,5 kb et 3,8 kb
   • PH21 - digérer par EcoRI pour donner des bandes de 4,5 kb, 2,8 kb et 0,2 kb
   • pFdelta6 - digérer avec HindIII pour donner des bandes de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb et 1,5 kb

2. Préparation de l'Homme cellules rénales 293 (HEK293) embryonnaires pour la transfection (2 - 3 jours)

1. Deux plaques de 80% confluentes de 150 cm ² flacons de cellules HEK293 en cinq plats 15 cm de diamètre de culture de tissus Nunc. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence avant la transfection (environ 48 heures après placage). Cellules en culture en milieu standard Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec faible taux de glucose contenant 10% de sérum de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / 100 pg / ml de streptomycine.
2. 3 heures avant la transfection retirer DMEM et le remplacer par Iscove«Moyen s de Dulbecco modifié (IMDM) contenant 5% de sérum de veau foetal.

3. La transfection de plasmides viraux (~ 1 heure pour la transfection, 3 jours d'incubation)

1. Préparer les informations suivantes pour un seul lot (5 x 15 cm des plaques de culture de tissu) du virus:
   • 62,5 ug de plasmide AAV
   • 125 ug pFdelta6
   • 31,25 mg pRV1
   • 31,25 mg PH21
   • 1650 ul de 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. Dans une classe de filtre 2 capot de culture de tissus stériles le mélange de transfection dans un tube de 50 ml.
3. Alors vortex de la solution, ajouter rapidement 13 ml de HEPES x 2 saline tamponnée (pH 7,05). Replacer le couvercle du tube de 50 ml et de continuer à vortex pendant 15 secondes. Laisser reposer pendant 1 minute 45 secondes, un fin précipité blanc doit se former.
4. Doucement ajouter 5 ml de la solution de transfection pour chaque plat de 15 cm de culture de tissu. Swirl plaques pour mélanger et retourner à l'incubateur.
5. 16 heures après transfection retirer milieu IMDM et remplacer par du DMEM.

4. Lyse des cellules et la récolte de rAAVs (2 heures)

1. 72 heures après transfection, retirez le support de plaques de culture cellulaire et le jeter. Tous les déchets doivent être traités avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié.
2. Lavez délicatement les cellules de phosphate de 1x chaude saline tamponnée (PBS, pH 7,4).
3. Ajouter 25 ml de PBS chaude à chaque plaque et retirez délicatement les cellules avec un racleur de cellules. Recueillir suspension dans des tubes de 50 ml.
4. Pellet cellules à 800 xg pendant 10 minutes.
5. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 150 mM de NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, utiliser 10 ml par plaque de culture tissulaire. Scindé en deux tubes de 50 ml.
6. Préparer une nouvelle solution de désoxycholate de sodium à 10% en DH ₂ O. Ajouter 1,25 ml de cette dans chaque tube pour une concentration finale de 0,5%. Ajouter benzonase nucléase à une concentration finale de 50 unités par ml. Mélanger soigneusement le tube.
7. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
8. Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 3000 xg pendant 15 minutes. Transfert à tube de 50 ml frais, s'assurer que tous les débris cellulaires a été enlevée pour empêcher le blocage des colonnes d'héparine (voir étape 5). A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C avant de continuer. Nous avons stocké des échantillons pendant plusieurs semaines à -20 ° C sans réduction de l'infectiosité.

5. Purification sur colonne d'héparine de rAAVs (2 - 3 heures)

1. Configuration des colonnes HiTrap héparine en utilisant une pompe péristaltique afin que les solutions de flux dans la colonne à 1 ml par minute pour les étapes 5.2 à 5.4. Il est important de s'assurer qu'aucune bulle d'air sont introduits dans la colonne d'héparine.
2. Equilibrer la colonne avec 10 ml de NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 8,0.
3. Appliquer 50 ml solution de virus de la colonne et permettre de circuler à travers.
4. Laver la colonne avec 20 ml de NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 8,0.
5. En utilisant une seringue de 5 ml de continuer à laver les colonnes wvec 1 ml de NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, puis 1 ml de NaCl 300 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. Jeter l'effluent à travers.
6. Utiliser seringues de 5 ml et éluer une légère pression du virus de la colonne en appliquant:
   • 1,5 ml de NaCl 400 mM, Tris 20 mM, pH 8,0
   • 3,0 ml de NaCl 450 mM, Tris 20 mM, pH 8,0
   • 1,5 ml de NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 8,0
   • Collectionnez ces dans un tube à centrifuger de 15 ml.

6. Concentration et la filtration stérile de rAAVs (1 heure)

1. Concentré vecteur en utilisant Amicon ultra-4 unités de filtration centrifuge avec une coupure 100 000 poids moléculaire. Charge de 4 ml d'éluat de la colonne dans le concentrateur et centrifuger à 2000 xg pendant 2 minutes (à température ambiante). Jeter accréditives et le concentrateur de rechargement avec une solution de virus restants et centrifugation répéter. Le volume concentré devrait être d'environ 250 pi. Si le volume de concentré est beaucoup plus que cela, jeter le flux de trâce et de continuer à centrifugeuse dans une minute jusqu'à ce que les mesures de volume est d'environ 250 pi.
2. Ajouter 250 pi de PBS au virus pour un volume final de 500 pl et retirer du concentrateur.
3. Filtrer à travers un vecteur de diamètre filtre de 0,2 um 13 mm seringue. Vecteur devraient être aliquotés et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

7. Titrage des stocks viraux (3 jours)

Cela nécessite un promoteur qui est actif dans les cellules HEK293 conduire un gène rapporteur ou un produit du gène immunocytochimique détectable. Lorsque la production d'un vecteur qui n'est pas compatible avec les cellules HEK293 autres lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires peut être utilisé.

1. Préparer 18 poly-L-lysine lamelles de verre enduit ou 18 puits de diapositives chambre de Nunc par ensemencement des cellules HEK293 de sorte qu'ils sont 40 - 50% confluentes. Pour le titrage de Cre dépendant rAAVs utiliser les cellules HEK293 qui expriment de façon stable la recombinase Cre ^2.
2. Infect chaque puits avec de série Dilutions du vecteur AAV (figure 2A). Utilisez 3 puits par dilution. Nous avons régulièrement ajouter des virus directement à chaque puits.
3. Après 72 heures corriger les cellules HEK293 en ajoutant un volume égal de 4% de paraformaldéhyde (PFA) à moyenne (ce qui donne une concentration finale de 2% PFA) pendant dix minutes à température ambiante.
4. Laver la cellule à trois reprises dans du PBS, rincer à l'dH ₂ O et lamelle.
5. Comptez le nombre de cellules transduites par les trois puits qui ont le plus haut facteur de dilution, mais contient encore des cellules infectées, trouver le moyen de ces derniers et le multiplier par le facteur de dilution de donner le nombre d'unités infectieuses par microlitre (figure 2B).

8. Résultats prévus

HEK293 transduites avec un encodage virus renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) sont présentés dans la figure 2B. Nous avons généralement d'atteindre des titres cohérents d'environ 6 x 10 ⁶ particules infectieuses par litre micro. Nous utilisons régulièrement ces vecteurs pour stéréotaxique Injection dans le cerveau de rongeurs adultes. Ceci fournit une technique puissante pour la région spécifique l'expression des gènes ^2. Pour combiner cette spécificité région avec un type de cellule d'expression génique sélective nous injectons de la recombinase Cre dépendant rAAVs dans les régions cibles de Cre-souris transgéniques ^2. Figure 2C-E montre des exemples d'injections stéréotaxiques de Cre dépendant rAAVs encodage eGFP dans différentes régions du cerveau des souris adultes parvalbumine-Cre transgéniques ^3.

Figure 1. Illustration schématique du protocole pour la production de rAAV. . 1) les cellules HEK293 sont plaquées et cultivées à 70 - 80% de confluence. 2.) Plasmides AAV et d'aide sont préparés et transfecté dans les cellules HEK293. 3.) Medium est modifié pour revenir à DMEM 16 heures après transfection et les cellules HEK293 sont cultivées pour un autre 56 heures. 4.) HEK293 sont récoltées et lysées. vecteurs rAAV sont séparés des débris cellulaires par centrifugation. 5.) Les particules virales sont purifiées à travers des colonnes d'héparine avant la concentration et la stérilisation. 6.) HEK293 sont cultivés sur des plaques de 24 puits et les infecter avec des dilutions en série du vecteur AAV pour déterminer le nombre d'unités infectieuses.

Figure 2. Titrage et en application in vivo de rAAV1 / 2. (A) l'installation des cellules HEK293 pour la mesure de titre viral. Cellules HEK293 sont transduites avec des dilutions en série de rAAVs. C, le contrôle non infectés, N, 1 pl de stock viral non dilué. (B) Hek293 cellules infectées par rAAVs exprimant eGFP. (CE) expression de l'EGFP virale est limitée à Cre-neurones exprimant dans les régions cibles différentes de souris transgéniques parvalbumine-Cre après l'injection stéréotaxique de Cre-activé rAAVs. Des exemples montrent des images immunoréactivité GFP dans (C) pallidus l'réticulaire du thalamus et le globus, (D) le gyrus denté et (E) de la région CA1 de l'hippocampe. DG, deNtate gyrus; RT, le noyau réticulaire thalamique; GP, le globus pallidus. Barres d'échelle: B, 500 um; C, 100 um; D, 100 um; E, 500 um.

Discussion

vecteurs rAAV sont de plus en plus précieuse pour les études in vivo chez l'animal. Ici, nous avons décrit un protocole simple et peu coûteuse pour produire rAAVs, ce qui peut faciliter l'application généralisée de ce vecteur utile en évitant l'externalisation coûteuse de la production de virus pour les entreprises. Le protocole (basé sur la référence 1) décrit la production de chimères rAAV1 / 2 vecteurs contenant des protéines de capside des deux sérotypes parental à ⁴ rapports égaux. La purification des vecteurs rAAV en se liant à l'héparine colonnes repose sur l'expression des protéines de capside AAV2, mais peut être combiné avec d'autres sérotypes que AAV1 décrites ici. En outre, les AAV6 a été signalé à lier à l'héparine, mais avec une affinité réduite, et pourrait potentiellement être purifié par des colonnes d'héparine en utilisant cette procédure ^5,6. Il faut noter cependant que d'autres sérotypes nécessitera différentes concentrations de NaCl pour élution sur colonne d'héparine ^5,7.

Emballage génomes rAAV a été montré pour être optimal entre 4,1 et 4,9 kb avec une forte réduction de l'efficacité des emballages jusqu'à 5,2 kb ^8. Cette limite de l'emballage peut être considéré comme le plus grand inconvénient du système rAAV, puisque le type spécifique de cellules régulation de l'expression du transgène est généralement réalisée par des éléments agissant en cis grands qui ne peuvent pas être logés dans les particules de petite AAV. Pour surmonter lots titre faible, tels que ceux résultant de tenter de gènes colis qui sont proches de la limite d'emballage AAV nous sommes séparés lots combinant virale concentrée à 250 ul dans un lot de 500 ul, plutôt que d'ajouter du PBS comme décrit dans l'étape 6.3. Fiable type cellulaire transduction spécifiques peuvent être obtenus en combinant Cre-pilote des souris et des cassettes rAAV conditionnelle (voir ci-dessous) pour éviter d'étirer à la limite de l'emballage.

Fait à noter, tout ce protocole tente de fournir facile à suivre les instructions sur la production de t hauteITER rAAV, elle nécessite la présence de fragments de protéine de capside AAV2 pour la purification par chromatographie d'affinité d'héparine. Sérotypes autres que AAV2 doit être purifiée en utilisant des procédures de rechange ^9. Un avantage de purification sur colonne d'héparine est il est censé produire des vecteurs AAV qui ont un taux plus infectieux que ceux produits en utilisant un gradient de chlorure de césium ^10. Cependant, il ya aussi quelques inconvénients à cette méthode. Par exemple, d'autres protéines qui se lient l'héparine peut également être présents dans le stock viral purifié. Alors que le tropisme de l'héparine purifiée vecteurs peuvent être influencés par le titre en vecteur ^10, notre approche pour cibler spécifiquement soit ²⁰ excitateurs ou inhibiteurs des neurones (Fig. 2) emploie Cre induit l'activation de l'expression du transgène AAV-médiatisée et est indépendante du titre. Une alternative à la purification sur colonne d'héparine est l'utilisation d'un gradient de densité iodixanol, qui produit un titre supérieur et de la préparation virale plus pur que l'utilisation deun gradient de chlorure de césium ^10. Cette méthode peut également être combiné avec purification sur colonne d'héparine pour produire un vecteur qui est supérieure à 99% pur ^11. Par conséquent, un examen attentif doit être pris par des groupes individuels quant à la méthode de purification virale est le meilleur pour leur application particulière aval.

Le problème le plus fréquent associé à ce protocole est faible titre viral. Dans notre expérience, cela peut généralement être attribuée à l'efficacité de transfection faible, ou l'élution du virus à partir des colonnes d'héparine. Tous les matériaux de transfection doit être à température ambiante avant la transfection, et transfections test doit être effectué à trouver les conditions optimales dans chaque laboratoire. D'autres méthodes de transfection, tels que la lipofectamine, sont très efficaces, mais peut être prohibitif. En outre, la concentration et du pH des solutions d'héparine élution de la colonne est critique pour l'élution complète des virions à partir witho colonnes d'héparinedommages ut. Un autre point important est que les cellules de conditionnement doit bien adhérer à la surface des boîtes de culture tissulaire. Si les cellules se détachent à un certain stade de la procédure, il est conseillé de mettre fin à l'expérience et le dégivrage d'un nouveau flacon de cellules.

Spatio-temporelle contrôle de l'expression du transgène chez les rongeurs est facilement réalisé en ciblant anatomiques précis et le stade de développement de l'animal. Efficace le transfert de gène AAV-médiatisée a été démontré in utero ^12,13. Dans le cerveau adulte, la zone infectée avec des particules rAAV après l'injection stéréotaxique peut être réglée de très petites régions ciblées, à des domaines beaucoup plus grande, non seulement par des changements dans le titre viral mais aussi en modifiant les paramètres d'injection. Il s'agit notamment du volume et de rapidité d'injections et de l'inclusion du mannitol polyol avec la suspension de ¹⁴ virus. Le mannitol peut aussi être utilisé pour améliorer l'infection d'une variété de tissus après injection systémique rAAV ^{15 <}/ Sup>.

La capacité de conditionnement de rAAV (environ 4,7 kb) est probablement le facteur le plus limitant en termes de gènes qui peuvent être exprimées à partir de ces vecteurs viraux. Cependant, des études récentes ont montré que cela peut être partiellement surmonté par fractionnement gènes plus ou cassettes d'expression dans des vecteurs rAAV séparées et l'introduction d'une séquence de transition, initier l'expression des gènes lors des virions infectent la même cellule ^16. Les niveaux d'expression des gènes portés par les vecteurs rAAV peut aussi être grandement améliorée en utilisant l'auto-gratuit vecteurs rAAV ^17. Injection stéréotaxique de vecteurs rAAV fournit une méthode rapide, peu coûteux et puissant pour induire l'expression des gènes de façon spécifique à la région. En combinaison avec deux stratégies de génération de l'interférence ARN ^{ND 18} rAAVs peut également être utilisé pour la région spécifique du gène-assommer. rAAVs peut être combiné avec Cre-souris transgéniques ou de type cellulaire promoteurs spécifiques à atteindre et des circuits de type cellulaireSpécifiques à l'expression des gènes, permettant les manipulations génétiques à haute résolution spatiale ^2,19-21, tandis rAAVs raccord avec par exemple le système Tet ajoute le contrôle temporel sur le virus de l'expression génique à médiation ^22,23. Ces exemples illustrent l'énorme potentiel combinatoire de ces vecteurs et prédisent une augmentation rapide de rAAV études basées sur les années à venir.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Amicon Ultra filtres centrifuges	Millipore	UFC810024	100000 MWCO
Benzonase nucléase	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco Eagle modifié (DMEM)	Invitrogen	10567014	Supplément de 10% de SVF et 10 unités / ml penicillin/100 pg / ml de streptomycine
Cellules HEK293	American Type Culture Collection	CRL-1573	Utilisez au passage de moins de 30
HEPES solution saline tamponnée	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap héparine cartouche	Sigma-Aldrich	54836
Iscove Dulbecco modifié par support	Invitrogen	12440-053	Supplément de 5% SVF
Désoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	D5670	Faire une solution fraîche pour chaque lot
15 cm plats culture tissulaire	Fisher Scientific	157150
Stbl2 cellules compétentes	Invitrogen	10268-019
Solution de Virkon	Fisher Scientific	NC9821357	Laisser pour désinfecter la nuit avant de les jeter à la vidange