Production et détection d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cancers

Résumé

Ici, nous proposons des méthodes simples pour tester et évaluer la présence d'espèces réactives de l'oxygène dans les cellules.

Résumé

Espèces réactives de l'oxygène comprennent un certain nombre de molécules qui endommagent l'ADN et d'ARN et d'oxyder les protéines et les lipides (peroxydation lipidique). Ces molécules réactives contiennent un atome d'oxygène et comprennent H ₂ O ₂ (peroxyde d'hydrogène), NO (oxyde nitrique), O ₂ ^- (anion oxyde), le peroxynitrite (ONOO ^-), l'acide hydrochlorous (HOCl), et le radical hydroxyle (OH ^-) .

Espèces oxydantes sont produites non seulement dans des situations pathologiques (cancers, la reperfusion ischémique /, les pathologies neurologiques et cardiovasculaires, les maladies infectieuses, maladies inflammatoires ^{1, 2} maladies auto-immunes, etc ...) mais également lors de situations physiologiques (non pathologiques), tels que le métabolisme cellulaire ^{3 , 4.} En effet, les ROS jouent un rôle important dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire (prolifération, l'activation des cellules ^{5, 6, 7} migrations etc.). ROS peut être nuisible (elle est alors appelée"Stress oxydatif et nitrosatif»), lorsqu'elle est produite en grande quantité dans les compartiments intracellulaires et les cellules répondent généralement à des ROS par upregulating antioxydants tels que la superoxyde dismutase (SOD) et catalase (CAT), glutathion peroxydase (GPx) et glutathion (GSH) qui protège entre eux en convertissant les dangereux radicaux libres des molécules inoffensives (l'eau). Les vitamines C et E ont également été décrits comme des charognards ROS (antioxydants).

Les radicaux libres sont bénéfiques en faible quantité ^3. Macrophages et des neutrophiles réponses immunitaires à médiation impliquent la production et la libération de NO, ce qui inhibe les virus, les pathogènes et la prolifération tumorale ^8. NO réagit également avec d'autres ROS et donc, a aussi un rôle comme un détoxifiant (scavenger ROS). Enfin NO agit sur ​​les navires de réguler le flux sanguin qui est important pour l'adaptation du muscle à l'exercice prolongé ^{9, 10.} Plusieurs publications ont également démontré que les ROS sont impliqués dans des Sénateurs d'insulineitivity ^{11, 12.}

De nombreuses méthodes pour évaluer la production de ROS sont disponibles. Dans cet article, nous proposons plusieurs tests simples, rapides et abordables; ces tests ont été validés par de nombreuses publications et sont couramment utilisées pour détecter les ROS ou de ses effets dans les cellules de mammifères. Si certains de ces dosages permettent de déceler plusieurs ROS, d'autres ne détecter que d'un seul ROS.

Protocole

1. La détection des ROS en utilisant carboxy-H ₂ DCFDA

Carboxy-H ₂ DCFDA est non fluorescent, mais en présence des ROS, quand ce réactif est oxydé, il devient vert fluorescent.

1. Immédiatement avant utilisation, préparer une solution de base fraîches de carboxy-H ₂ DCFDA dans le diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) ou de l'éthanol à 100%. Évitez de multiples dégel / gel des cycles de votre teinture.
2. Laver les cellules avec HEPES solution saline tamponnée (HBSS) ou un tampon phosphate salin (PBS) pour enlever les traces du support original.
3. Chargez les cellules avec le colorant (et le colorant de contrôle, l'article cf. note). Dans cet essai nous avons utilisé Jurkat, une ligne de la leucémie humaine des cellules. Utilisez carboxy-H ₂ DCFDA à une concentration finale de 1 uM en milieu de culture régulier avec du sérum réduite (2%).
4. Incuber les cultures pendant 30 minutes dans l'obscurité, dans un conventionnelles incubateur (37 ° C, 5% de CO2). Jeter toutes les solutions de colorant utilisé.
5. Retirer carboxy-H ₂ DCFDA contenant du milieu et laver deux fois avec HBSS ou PBS. A partir de ce pas en avant, protéger vos cellules de la lumière.
6. Ajouter un milieu frais contenant votre médicament de choix pour les ₂ carboxy-H-DCFDA chargés cellules et incuber comme désiré. Pour cet exemple nous utilisons H ₂ O ₂ (0,03%) pendant 1 heure.
7. Évaluer les ROS en mettant immédiatement l'analyse de vos cellules par cytométrie en flux en utilisant le canal FL1 (fluorescence verte), ou par lecteur de plaque à fluorescence, ou par microscopie à fluorescence. La fluorescence peut être détectée en utilisant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission qui sont appropriés pour la fluorescence verte.

Note: Les contrôles doivent inclure carboxy-H ₂ DCFDA-chargés des cellules non traitées et non colorées cellules non traitées. Carboxy-H ₂ DCFDA est connu pour détecter les peroxydes, mais pourrait également être oxydé par d'autres ERO. Ce réactif peut également être modifié par d'autres moyens, colorant contrôler l'oxydation insensible comme le 5 - (et 6)-carboxy-2 ', 7'-dichlordiacétate ofluorescein (carboxy-DCFDA) devrait donc être inclus dans le test.

2. Mesure de l'oxyde (NO) de production d'azote

Vous aurez besoin de sulfanilamide et N-1-napthylethylenediamine dichlorhydrate (NED) des solutions, et la norme de nitrite. Ce dosage est appelé dosage de Griess.

Solution de NED: Faire une solution à 0,1% de N-1-napthylethylenediamine dichlorhydrate dilué dans une solution stérile de water.Sulfanilamide: Faire une solution à 1% de sulfanilamide dans l'acide phosphorique dilué à 5%. Standard de nitrite: Diluer le nitrite de sodium 0,1 M standard de stock à 100 microns en milieu stérile, faire une dilution en série dans le même milieu.

Conditions de stockage: Conservez les produits chimiques selon les directives du fabricant à la température ambiante. Une fois reconstituée, la NED et de solutions sulfanilamide sont stockées immédiatement après usage à 4 ° C, dans l'obscurité, et pour un maximum de 3 mois.

1. Cellules en culture dans une plaque à 96 puits,l'utilisation triplicatas pour chaque condition, et incluent des contrôles appropriés en fonction de vos expériences.
2. Traiter les cellules pour induire la production de NO. Dans notre expérience, nous utilisons un lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) et IL-4 recombinante pour le traitement de nos cellules. Dans ce protocole, nous avons utilisé RAW 264.7, une lignée de cellules macrophages de souris (souris leucémiques lignée monocytaire de cellules macrophages).
3. Le jour du test, amener les deux réactifs à température ambiante.
4. Spin votre assiette, la collecte et le transfert de surnageants de cellules 50 pl d'une nouvelle plaque de 96 puits. Préparer limitant la dilution des puits de votre solution standard en stock pour faire une courbe standard.
5. Ajouter 50 pl de la solution de sulfanilamide à chaque échantillon et contrôle bien et bien mélanger.
6. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes dans l'obscurité.
7. Ajouter 50 pl de la solution de dichlorhydrate de N-1-napthylethylenediamine à chaque échantillon et contrôle bien et bien mélanger.
8. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes dans l'obscurité.
9. Mesure Absorbance immédiatement à l'aide d'un lecteur de plaque avec filtre de longueurs d'onde entre 520nm et 550nm.

Si vous utilisez différents plaque / plat tailles, utilisez 1/1/1 volume pour chaque solution et surnageant de l'échantillon.

Une couleur violette apparaîtra dans le puits positifs. Les résultats obtenus avec la norme vous aidera à vérifier la stabilité de vos solutions.

3. La détection des ROS action: protéines oxydées

Une méthode différente pour identifier la production de ROS est de regarder les résultats finaux en détectant l'oxydation des protéines. En effet, les ROS modifier le glutathion, un antioxydant qui est exprimé dans la plupart des cellules et joue un rôle protecteur contre les ROS. Suite à l'oxydation par les ROS, la modification de la glutathion réduit (GSH) des résultats dans le sulfhydryle (thiol) le groupe de sa cystéine étant liée à une seconde glutathion par un pont disulfure. Cela conduit à la formation d'une protéine dimérisée (GSSG protéine oxydée). GSH peut être restauré via une modification de GSSG par la réductase enzyme glutathion. La hausse du ratio de GSSG / GSH reflète le stress oxydatif. Le test suivant est basé sur la détection et la quantification de ces protéines oxydées. Cette méthode n'est pas sélective pour des ROS, mais détecte plutôt les effets du NO, H ₂ O _2, O ₂ ^- et d'autres ROS. Ici on mesure la quantité totale d'oxydé (GSSG) et réduit (GSH) glutathion en utilisant des signaux bioluminescents.

1. Graine de vos cellules dans une plaque à 96 puits (blanc / transparent, fond plat) comme d'habitude. Pour notre expérience, nous avons utilisé 1x10 ⁴ cellules par puits pour adhérente RAW 264.7 et A549 et les cellules Jurkat suspension. Selon la taille de vos cellules de ces chiffres pourraient être ajustés. Nous recommandons aux cellules de la plaque adhérente de la journée avant le test afin de leur permettre d'attacher à la plaque. Assez puits devraient être préparés pour la détection de la protéine oxydée et réduite ainsi que pour "seulement moyenne" etcellules non traitées comme témoins. Utilisez triplicatas pour toutes les conditions.
2. Traitez vos cellules avec votre médicament pour le temps nécessaire. Ici, nous avons traité les cellules Jurkat et A549 pour 1h avec H ₂ O ₂ (à 5 mm et 2,5 mm respectivement). Des cellules RAW 264.7 ont été traités avec 200ng/ml de LPS pendant 16 h. Pendant ce temps d'incubation, apportez tous vos réactifs à température ambiante (RT). Faire tous les réactifs ne dépassant pas 30 minutes avant d'effectuer le test. Le tableau ci-dessous montre les volumes de réactifs par puits. Lorsque c'est possible, il est important de retirer le support contenant l'agent réducteur avant de procéder à l'essai.

	Les cellules adhérentes		Les cellules en suspension
	Total des Lysis Glu	Oxydé Lysis Glu	Total des Lysis Glu	Oxydé Lysis Glu
NEM, 25mm	aucune	0.5μl	aucune	0.5μl
Luciférine-NT	1 pl	1 pl	1 pl	1 pl
Lysis Buffer passif, 5X	10 ul	10 ul	10 ul	10 ul
L'eau distillée	39.0μl	38.5μl	14μl	13.5μl
Le volume final par puits	50 pl	50 pl	25 pi	25 pi

3. Retirer moyenne des puits avec des cellules adhérentes. Ne retirez pas moyen dans les puits avec les cellules en suspension.
4. Ajouter réduite réactif de lyse glutathion oxydé ou réactif de lyse glutathion dans les puits correspondants et agiter pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Ajouter le réactif luciférine et la génération Incubate pendant 30 minutes à température ambiante.
6. Ajouter le réactif de détection luciférine et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
7. Lire le signal de bioluminescence au temps d'intégration de 0.25 à 1 seconde par puits en utilisant un luminomètre lecteur de plaque.

	Les cellules adhérentes	Les cellules en suspension
Le nombre de cellules par puits	1x10 4	1x10 4
Suspension cellulaire par puits + médicament	100 pi, à être enlevés avant 3.4	25 pi, de ne pas être retirée
Réduction Réactif de lyse glutathion	50 ul	25 pi
Oxydé Réactif de lyse glutathion	50 ul	25 pi
Réactif Génération Luciférine	50 ul	50 ul
Réactif de détection Luciférine	100 ul	100 ul

4. Les résultats représentatifs:

Figure 1: Détection de ROS en utilisant carboxy-H2DCFDA colorant. Cellules Jurkat (lignée cellulaire humaine de leucémie) et traités par H ₂ O ₂ ont été comparés à cellules non traitées. ROS induit la modification de la carboxy-H ₂ DCFDA qui émet une fluorescence verte détectée par cytométrie en flux, le pic de fluorescence dans H ₂ O ₂ cellules traitées décalage par rapport aux sommets de commandes (H ₂ O ₂ cellules traitées tachée de colorant d'oxydation insensible et non cellules traitées colorés avec carboxy-H ₂ DCFDA). Les résultats confirment la présence de ROS dans les cellules traitées.

Figure 2 Détection of NON à l'aide des réactifs de Griess. Des cellules RAW 264.7 (macrophages de souris) ont été traitées avec du LPS et l'IL-4. Une augmentation significative de la production de NO a été détectée dans les cellules traitées par rapport au contrôle des cellules non traitées.

Les lignées cellulaires	Non-traité	Traités
Raw 264,7	13,0	8.3
A549	21,6	10,5
Jurkat	5.2	2.8

Tableau 1: Détection de ROS médiée oxydation des protéines. Des cellules RAW 264.7 ont été traitées avec du LPS, Jurkat et A549 (cancer du poumon humain) ont été traités avec des cellules H ₂ O _2. Les résultats sont exprimés comme le ratio réduit (GSH) / oxydé (GSSG) du glutathion. Baisse des ratios des glutathion (GSH) / (GSSG) ont été détectés dans les cellules traitées par rapport àle contrôle des cellules non traitées, révélant que les protéines étaient plus oxydé dans les cellules traitées.

Discussion

Plusieurs situations pathologiques telles que les maladies inflammatoires, les cancers, l'ischémie / reperfusion, et aussi des traitements tels que radiothérapie ou la chimiothérapie (cisplatine par exemple) induisent une surproduction de ROS. Ainsi, en détectant et en mesurant les niveaux de ROS est important dans de nombreux fondamentale, les études pré-cliniques et cliniques. Toutefois, les ROS sont des demi-vies très courtes et pourrait être compliqué à détecter. Ici, nous proposons des tests simples ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
5 - (et 6)-carboxy-2 ', 7'-dichlorofluorescéine diacétate (carboxy-DCFDA)	Molecular Probes	C369	de contrôle
carboxy-H 2 DCFDA	Molecular Probes	C400
Sulfanilamide	Sigma	S9251-100G
N-1-napthylethylenediamine dichlorhydrate	Sigma	N9125-10G
Standard de nitrite	Sigma	237213-100G
GSH / GSSG-Glo Assay	Promega	V6612	Pour quantifier oxydé, réduit ou oxydé / glutathion réduit