L'isolement et la culture de neurones de l'hippocampe de souris pendant la grossesse

Résumé

Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l'hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l'utilisation d'une couche de cellules nourricières gliales.

Résumé

Les cultures primaires de rat et de souris neurones de l'hippocampe sont largement utilisés pour révéler les mécanismes cellulaires de la neurobiologie. En isolant et en pleine croissance des neurones individuels, les chercheurs sont capables d'analyser les propriétés liées à la traite cellulaire, structure cellulaire et la localisation des protéines individuelles en utilisant une variété de techniques biochimiques. Les résultats de ces expériences sont essentiels pour tester les théories portant sur les bases neurales de la mémoire et l'apprentissage. Cependant, des résultats sans ambiguïté de ces formes d'expériences sont fondées sur la capacité de croître des cultures de neurones à la contamination minimale par d'autres types de cellules du cerveau. Dans ce protocole, nous utilisons des supports spécifiques conçus pour la croissance des neurones et une dissection minutieuse du tissu hippocampique embryonnaire pour optimiser la croissance des neurones sains tout en minimisant les types de cellules contaminantes (astrocytes par exemple). Embryonnaire de la souris tissu hippocampique peut être plus difficile d'isoler que les tissus des rongeurs similaire en raison de la taille de l'échantillon pour dissection. Nous montrons les techniques de dissection détaillée de l'hippocampe à partir embryonnaires souriceaux jour 19 (E19). Une fois le tissu hippocampique est isolée, la dissociation des cellules neuronales douce est obtenue avec une concentration diluée de la trypsine et la rupture mécanique des cellules destiné à séparer les tissus conjonctifs tout en fournissant un minimum de dégâts à des cellules individuelles. Une description détaillée de la façon de préparer les pipettes à être utilisé dans la perturbation est inclus. Densités optimales de placage sont prévus pour l'immuno-fluorescence protocoles afin de maximiser la culture de cellules avec succès. Le protocole prévoit une technique rapide (environ 2 h) et efficace pour la culture des cellules neuronales à partir de tissus de la souris hippocampe.

Protocole

1. Mise en place avant la récolte

1. Pour générer chiots prénatales pour la récolte des neurones, planifier la reproduction entre les souris adultes 19 jours avant le jour de l'isolement des neurones. (C57BL / 6 ans 2-8 mois ont été utilisés dans les accouplements pour les fins de l'élaboration de ce protocole). Accouplement réussi peut être confirmé par la détection d'un bouchon vaginal dans la confirmation de femmes, des palpitations ou visuelle de la grossesse.
2. Le jour avant l'isolement des neurones:
   1. Pour les applications immunofluorescence, des lamelles de verre manteau dans une plaque de 24 puits avec une légère couche de 3:1 collagène 1, Rat Tail: poly-D-Lysine solution.
   2. Pour les applications de culture cellulaire, manteau tissu approprié taille en plastique culture de la céramique avec une légère couche de 3:1 collagène 1, Rat Tail: poly-D-Lysine solution.
3. Reposez les plaques découvertes dans une hotte de culture tissulaire sous une lumière UV pendant la nuit.
4. Laver les plaques avec une solution de Hank stérile de l'équilibre salin (HBSS) avantà utiliser. Plaques enduites peuvent être remplis avec du HBSS et stocké jusqu'à une semaine à 4 ° C dans l'obscurité.

2. Récolte des tissus

1. La stérilité est toujours un facteur lors de la croissance des cultures de cellules primaires et en tant que telle, la plus grande prudence doit être exercée afin d'assurer l'environnement le plus stérile possible. Avec une attention particulière à une technique stérile, la dissection initiale et la récolte de tissu neural pour ce protocole peut être effectué en dehors d'une hotte à flux laminaire avec un risque minimal de contamination. Après la récolte initiale, toutes les étapes ultérieures doivent être menées sous des conditions stériles maximales au sein d'une hotte classé pour la culture cellulaire.
2. Euthanasier une souris enceinte à environ 19 jours post-fécondation par décapitation. L'utilisation de l'anesthésie pour euthanasier la femme enceinte n'est pas recommandée car l'anesthésie est connu pour causer la mort des cellules du cerveau (Stratmann, et al., 2010). En utilisant des ciseaux de dissection stériles et des pinces, de créer une ouverture dans le côté mi-ventrale de lasouris pour révéler complètement la cavité du corps. Les instruments peuvent être stérilisés à l'aide d'alcool et d'une flamme nue.
3. Chiots pendant la grossesse sera situé vers la partie postérieure de la cavité du corps de la souris et doit être facilement visible dans l'utérus. Avec autoclavés pinces stériles, ouvrez l'utérus et de supprimer les chiots. Décapitez chiots avec des produits frais de ciseaux stériles et chef lieu retiré sur une gaze stérile sous un microscope à dissection. Les instruments stériles et peuvent être autoclavés flamme nettoyés à l'aide d'alcool et d'une flamme nue avant et pendant l'utilisation.
4. L'aide de ciseaux stériles ou un scalpel, crâne ouvert de chiot à partir de la nuque vers le nez. Cette procédure peut normalement être achevée en insérant une extrémité des ciseaux dans le trou vertébral, puis de procéder avant. Retirez soigneusement l'ensemble du cerveau avec une pince. Placez le cerveau sur de la gaze stérile. L'utilisation d'un scalpel stérile, retirez le cervelet et inciser en bas de la ligne médiane du cerveau afin de le séparer en deux hémisphères (Figure 1) .
5. Saisir une petite section des méninges entourant l'hippocampe avec des pinces stériles et tirez doucement. Bien qu'il ne soit pas strictement nécessaire de retirer les méninges avant d'isoler l'hippocampe, la présence des méninges peut faire la dissection de l'hippocampe plus difficile en raison de la ténacité de la membrane. Dans les deux cas, l'hippocampe sera plus clairement visible après les méninges ont été supprimés. L'hippocampe est une structure incurvée qui commence dans la partie distale de l'hémisphère et se penche ventralement (Figure 2). Comme l'intérieur, concave, côté (caudale) est confrontée à un ventricule, il est déjà libre. Par conséquent, afin d'isoler l'hippocampe, on a besoin de couper le long du côté externe convexe. Après la dissection, soulevez doucement chaque hippocampes avec des pinces stériles tissus et le transfert dans une boîte de culture tissulaire petit chaudes (37 ° C) HBSS sous une hotte de culture cellulaire. Le tissu cérébral peuvent être combinés de multiples petits.

"> Tissu 3. Dissociation

1. Avec un scalpel stérile, les tissus du cerveau en douceur hachis dans 3 ml de HBSS stériles dans un plat de 100 mm culture de tissus.
2. Transférer le tissu haché et HBSS à un tube de 15 ml conique. Ajouter 1,5 ml de HBSS et 0,5 ml de solution de trypsine à 0,25% pour un volume total de 5 ml.
3. Cap et retourner doucement le tube 4-5 fois pour mélanger. Essayer d'éviter la production de bulles que l'ADN libéré à partir du tissu digéré adhère aux bulles et provoquer le tissu hachées à flotter au lieu de se fixer au fond du tube (figure 3).
4. Incuber tissu hippocampique à 37 ° C pendant 15 minutes, retournant le tube comme ci-dessus toutes les 5 minutes.
5. Laisser le tissu à se déposer au fond du tube.
6. Soin retirer l'excès de solution à l'aide d'une pipette stérile, laissant intact le tissu au fond du tube.
7. Laver les tissus culot avec 5 ml de HBSS à 37 ° C pendant 5 minutes. Répéter un total de 3 fois. Autoriser les tissus complètement réglerau fond du tube à chaque fois avant de passer à l'étape de lavage suivante.
8. Retirez le lavage final à partir du culot de tissus et de le remplacer par 2 ml de HBSS frais.

4. Neuron trituration

1. Avant de commencer les étapes de trituration, vous aurez besoin pour préparer polies au feu pipettes Pasteur. L'utilisation d'un brûleur Bunson, tenir une stérile à 9 pouces pipette Pasteur pointe (figure 4a) dans la flamme jusqu'à un diamètre de l'ouverture pipette est d'environ 0,5 mm de diamètre et les bords de l'ouverture pour pipettes ont été arrondis légèrement (figure 4b). Permettez-pipette pour refroidir complètement avant de commencer le processus de trituration.
2. L'utilisation d'un stérile normale 9 pouces une pipette Pasteur, doucement triturer le tissu un total de 7 fois. Morceaux de tissu sont plus grandes normale à ce stade et devraient être autorisés à se déposer au fond du tube avant de passer à l'étape suivante.
3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube stérile de 50 ml conique.
4. Pour le tissu restant, ajouter 2 ml de HBSS stériles et triturer un total de 5 fois en utilisant le feu poli pipette Pasteur.
5. Autoriser tous les morceaux restants de tissus plus à se déposer au fond du tube et de combiner avec le surnageant surnageant précédente pour un total de 4 ml dissociées des cellules neuronales.

5. Plaquage portable

1. Compter les cellules dissociées en utilisant un hémocytomètre.
2. En règle générale, une fois le nombre de cellules ont été déterminés, il faut soustraire 20% de ce nombre définitif de rendre compte de toute la mort des cellules qui peuvent se produire après le placage.
3. Les cellules peuvent être étalées en utilisant les recommandations ci-dessous:
   Pour les lamelles dans une plaque à 24 puits - 6 x 10 ⁴ cellules / puits dans 0,5 ml
   Pour 60 plaques mm tissus Culture - 4 x 10 ⁵ cellules / plaque dans 3 ml
   Pour plaques de 100 mm de tissus Culture - 6 x 10 ⁶ cellules / plaque dans 6 ml
4. Mélanger le nombre de cellules appropriées avec le volume indiqué des médias Placage Neurobasal (NeurobasalLes supports contenant B27 Supplément [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamine Solution, 25 uM de glutamate (M. 147,13 g / mol), la pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 pg / ml) [250 pi / 50 ml] , 1 mM HEPES (M. 238,3 g / mol), 10% des donateurs cheval inactivé par la chaleur du sérum) et ajouter des cellules à plaques. Plaques agiter doucement pour répartir uniformément les cellules. Sérum de cheval HI-bailleurs de fonds est ajoutée à des médias de placage pour enrichir les cellules au cours des 24 premières heures de la croissance. Les cellules sont ensuite sevrés à partir du sérum et est retourné à un environnement sans sérum par la réduction de série du sérum à chaque remplacement des médias. Il convient également de noter que, bien que le glutamate à des concentrations plus élevées est toxique pour les cultures de cellules neuronales, à des concentrations inférieures ajoutées ici, il va inhiber la fixation de cellules non-neuronales ^11. Cependant, il ne devrait être ajoutée aux médias de placage pour les 24 premières heures de la culture et par la suite quitté sur un support quelconque d'alimentation afin de prévenir la neurotoxicité des cellules.
5. Pdentelles neurones dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant la nuit.
6. Retirez la moitié du volume des médias à partir des cellules et le remplacer par un même volume de médias d'alimentation Neurobasal (médias Neurobasal contenant B27 Supplément [1 ml / 50 ml], 0,5 mM Solution glutamine, pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 mg / ml) [250 pl / 50 ml], 1 mM de HEPES (M. 238,3 g / mole).
7. Les neurones doivent être nourris tous les 4 jours en enlevant la moitié des anciens médias et son remplacement par le même volume de Fresh Media alimentation Neurobasal. Processus neuronaux devrait commencer à être visible lors de la Journée 1 (figure 5a) et finissent par prévaloir par jour 10 (figure 5b).

6. Les résultats représentatifs

La capacité de croître et de la culture primaire des cellules neuronales est devenu un élément indispensable de la neuroscience. Les cultures primaires permettent au chercheur d'analyser les voies cellulaires spécifiques, modification chimique et de traitement, la cible loclisation et de la croissance dans un environnement contrôlé. Bon nombre de ces procédures utilisent la méthodologie sophistiquée pour visualiser les changements spécifiques dans les réponses cellulaires. Dans ce cas, neurones de l'hippocampe sont utilisées pour étudier les voies neuronales spécifiques qui se révéleraient difficile, voire impossible d'analyser dans le cerveau intact. Préparation de la proximité des populations homogènes de neurones à partir de zones spécifiques du cerveau est essentielle pour l'étude de la fonction cérébrale. Effets moléculaires dans les neurones individuels peuvent jouer un rôle dans la délimitation des voies d'ordre supérieur tels que la mémoire ou l'apprentissage. Comme ce protocole donne cultures relativement purs de neurones de l'hippocampe, sans la nécessité d'une couche nourricière de cellules gliales, ces neurones sont facilement utilisables pour les études d'immunofluorescence. Cependant, comme avec toute la culture primaire à partir d'organes contenant plusieurs types de cellules, une contamination par des cellules moins désirés peuvent se produire. Dans l'isolement de cellules neuronales, la contamination par les cellules gliales peuvent être un problème commun. Les cellules gliales cêtre facilement détecté une visualisation microscopique sur la culture en tant que leur morphologie diffère sensiblement des neurones cibles (figure 6). L'impact de la contamination par des cellules gliales dépendra de l'utilisation prévue des cultures. Si les cellules sont utilisées pour l'examen immuno-fluorescence, la contamination gliales ne peut être rien de plus qu'un désagrément lorsque vous essayez de photographier des neurones individuels. Toutefois, si les cultures de neurones doivent être utilisés pour l'analyse biochimique, toute contamination significative par les cellules gliales pourrait causer des changements majeurs dans les résultats. Moyens de répondre à la contamination de cellules gliales sont décrites plus loin dans la discussion.

Une fois que les neurones ont été isolées et cultivées avec succès dans la culture, une application typique est d'examiner les processus cellulaires immuno-fluorescence techniques. Comme l'illustre la figure 7, les organites, comme la mitochondrie, peut être teinté avec des colorants vitaux ajoutés aux milieux de culture avant de fixeration. Endogènes protéines cellulaires peuvent être visualisées à partir de cellules fixes en utilisant types immuno-fluorescence des techniques (figure 8). Une fois les cellules neuronales sont fixés, des anticorps spécifiques des protéines d'intérêt peuvent être introduits dans la cellule et ces protéines peuvent être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence. Des neurones en culture a également fournir au chercheur les moyens d'examiner les effets des protéines individuelles sur les fonctions neuronales. En utilisant une variété de techniques, y compris transfections d'ADN, l'électroporation ou de transduction virale, les protéines peuvent être surexprimé dans les cellules neuronales (figure 9). Comment neurones des cellules de répondre aux effets de la sur-exprimés protéines peut avoir des déductions directes sur la façon dont le cerveau peut répondre et vous offre la possibilité d'identifier des cibles cellulaires pour des traitements médicamenteux. Les détails de ces types d'expériences aller au-delà de la portée du présent document, mais ils ne montrent que les cultures préparés par cette technique sont adaptés à un large éventail de bas-sapplications tream. Toutefois, la simplicité globale de ce protocole, ainsi que, le court laps de temps nécessaire pour préparer ces cultures de neurones font une méthode idéale pour une utilisation en neurosciences aujourd'hui le laboratoire.

Figure 1. Dissection du cerveau de souris prénatale. La première incision est en bas de la ligne médiane du cerveau qui la sépare en deux hémisphères.

Figure 2. Localisation de l'hippocampe dans le cerveau de souris prénatale. Le striatum est déplacé de côté pour visualiser l'hippocampe et est noté par le incurvée structure "haricot" de type dans la région distale de chaque hémisphère.

Figure 3. La dissociation du tissu de l'hippocampe dans une solution de trypsine.

Figure 4. Embouts de pipette Pasteur utilisée dans la trituration de tissu hippocampique. (A) normale Pasteur pointe de pipette. (B) l'incendie poli Pasteur pointe de pipette. Prenez note des bords arrondis et la diminution d'environ 50% de la taille d'ouverture pipette.

Figure 5. Neurones de l'hippocampe isolé en utilisant cette procédure et plaqué au Nouveau-Brunswick avec les médias. La croissance des cellules (a) un jour après placage. Processus neuronaux commencent à être visibles lors de la Journée 1. (B) La croissance des cellules 10 jours après placage, neurites sont ramifiées et se chevauchent.

Figure 6. Neurones de l'hippocampe contaminés par les cellules gliales cultivées pendant 7 jours et colorées avec l'organite marqueur Mitotracker Rouge CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) et transfeDECT avec la GFP-LC3 utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Les mitochondries sont visibles dans toutes les cellules mais seulement un seul neurone a été avec succès transfectées avec la construction fluorescent. La contamination par les cellules gliales qui rend l'analyse de la GFP-LC3 expression dans les processus neuronaux difficiles à visualiser.

Figure 7. Neurones de l'hippocampe cultivées pendant 7 jours et colorées avec l'organite marqueur Mitotracker Rouge CM-H ₂ Xros (Invitrogen # M7513). Ce colorant vital est utilisé pour colorer les mitochondries actif dans des cellules de culture tissulaire. Les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde 4% / PBS et visualisés par microscopie à fluorescence. Le colorant lui-même est non-fluorescente jusqu'à oxydé dans les mitochondries. Mitochondries actif peut être vu à travers les processus neuronaux.

Figure 8. neurones de l'hippocampe cultivées pendant 7 jours, fixées avec du paraformaldéhyde 4% / PBS et immuno-colorées avec un anticorps monoclonal anti β-tubuline (Sigma # T0198). Après anticorps primaire, Oregon Green chèvre marqué-anticorps anti-souris secondaire (Invitrogen # O11033) a été ajouté et la fluorescence visualisé par microscopie.

Figure 9. L'hippocampe des cultures de neurones ont été cultivées pendant 5 jours et transfectées avec GFP-LC3β construction d'ADN en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Au jour 7, les cellules ont été fixées à l'aide de paraformaldéhyde à 4% / PBS et aggresomes avec LC3β GFP étiqueté incorporé dans leur membrane externe ont été visualisées en utilisant la microscopie à fluorescence. Aggresomes sont situés dans tout le corps cellulaire et neurites et sont indiqués par des flèches.

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Discussion

Cultures hippocampe ont été utilisés en biologie moléculaire pour plus de 20 ans. Bien qu'en principe, les cultures de neurones peuvent être fabriqués à partir de n'importe quelle partie du cerveau, l'hippocampe cultures se sont révélées être les plus populaires en raison de l'architecture relativement simple de la population de cellules nerveuses dans l'hippocampe ^7. Cultures d'hippocampe sont généralement fabriqués à partir de tard-étape tissu embryonnaire. Ce tissu e...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif	Vendeur	Numéro de catalogue
Collagène de queue de rat 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Solution saline équilibrée de Hanks	Invitrogen	14175-095
Solution de trypsine (1X) 0,25%, liquide	Invitrogen	15050-065
Neurobasal moyen (1X) liquide	Invitrogen	21103-049
B27 Supplément (50X) de liquide	Invitrogen	17504-044
L-glutamine 200 mM (100X) de liquide	Invitrogen	25030-149
Pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 pg / ml)	Invitrogen	15140-148
Cheval HI-sérum de donneur	Atlanta Biologicals	S12150H