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La Drosophila Oeuf chambre est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de localisation des ARNm. Afin de capturer les événements dynamiques qui sous-tendent les processus de localisation, rapide imagerie à haute résolution des tissus vivants est nécessaire. Ici, nous présentons un protocole pour la dissection et l'imagerie d'échantillons vivants avec une perturbation minimale.
Imagerie des cellules vivantes est une technique importante appliquée à un certain nombre de tissus de Drosophila utilisées comme modèles pour étudier des sujets tels que la spécification axe, la différenciation cellulaire et de l'organogenèse 1. Une bonne préparation des échantillons expérimentaux est un élément crucial, souvent négligé, étape. Le but de la préparation est de s'assurer de la pertinence physiologique et à créer les conditions optimales d'imagerie. Afin de maintenir la viabilité des tissus, il est essentiel pour éviter la déshydratation, l'hypoxie, la détérioration de surchauffe ou de milieu 2.
La chambre de Drosophila oeuf est un système bien établi pour examiner les questions relatives, mais sans s'y limiter, à la modélisation du corps, la localisation des ARNm et organisation du cytosquelette 3,4. Pour les chambres d'oeufs au début et à mi-étape, le montage dans de l'huile d'halocarbure est bon pour la survie en ce qu'il permet la libre diffusion de l'oxygène, prévient la déshydratation et de l'hypoxie et possède de superbes propriétés optiques pour la microscopie. Imle vieillissement des protéines fluorescentes est possible grâce à l'introduction de transgènes dans la chambre de l'œuf ou l'injection physique de l'ARN marqués, protéine ou des anticorps 5-7. Par exemple, plus de constructions à l'MS2 génome d'animaux permet l'observation en temps réel d'ARNm dans l'ovocyte 8. Ces constructions permettent le marquage in vivo d'ARNm grâce à l'utilisation de l'interaction bactériophage MS2 ARN tige-boucle avec son protéine d'enveloppe 9.
Ici, nous présentons un protocole pour l'extraction des ovaires ainsi que l'isolement ovarioles individuelles et des chambres d'œufs de la femelle chez la drosophile. Pour une description détaillée de la drosophile ovogenèse voir Allan Spradling C. (1993, réédité 2009) 10.
1. La préparation avant la drosophile pour la dissection (Selon E. Gavis, l'Université de Princeton)
Remarque: Vous pouvez pré-mélange une levure coller dans un récipient séparé et ajouter la pâte à la fiole avec une spatule.
2. La dissection des ovaires chez la drosophile
3. Ovarioles isolation
Remarque: Chaque ovaire contient environ 16 ovarioles constitués de 6 à 10 chambres d'œufs de différentes étapes disposées comme des perles sur une chaîne de 10.
Remarque: Avant d'isoler les ovarioles, ajuster la source lumineuse sur le microscope à dissection de telle sorte que l'éclairage frappe à un angle faible de l'échantillon. Cela donne la différence de l'échantillon et permet la visualisation des chambres des jeunes d'oeufs sur scène.
Remarque: ovarioles individuels seront de pause entre les stades jeunes (germarium de mettre en scène 10) que les stades les plus âgés sont trop gros pour être séparé de l'ovaire complète.
Remarque: La perforation d'un ovocyte stade avancé avec la sonde de dissection se traduira dans le cytoplasme des fuites dans l'huile et facilite l'extraction des ovarioles individuels très difficile. Si un ovocyte stade tardif est percé, passer à un ovaire frais.
Remarque: Il est conseillé de disséquer un ovaire chaque partir de plusieurs mouches plutôt que disséquer les deux ovaires de moins de mouches à augmenter le nombre n de mouches pour l'expérience.
Remarque: Une manipulation brutale de l'ovariole se traduira dans les ovocytes malsaines et peut conduire à des artefacts dans l'expérience.
Remarque: Les ovocytes va commencer à afficher les modifications phénotypiques dues au stress de 40 minutes après avoir été disséqués à partir de l'ovaire (Figure 7E comparer à F).
4. Isolation individuelles fin chambres oeufs de stade (d'après E. Gavis, l'Université de Princeton)
Remarque: La perforation d'un ovocyte en disséquant la fin chambres oeufs de stade n'est pas en condamnant comme i dissectionovarioles ertaines pour les jeunes stades.
Remarque: Pour les chambres stade de l'œuf 14, utiliser les forceps pour saisir les appendices dorsaux pour l'orientation.
5. Préparation injectable
Remarque: Pour l'injection d'ovocytes stade intermédiaire, orienter le ovarioles perpendiculairement à l'axe longitudinal de la lamelle.
6. L'injection de l'ARN fluorescent
Avant de commencer: Mettre en place le dispositif d'injection et la micro-manipulateurs de ces contrôles que l'aiguille d'injection est positionné sur le centre du champ de vue.
Remarque: Si vous utilisez un stade avec une capacité automatisée point de visite, il est conseillé de marquer toutes les étapes 8-9 pour l'injection des ovocytes avant de commencer. Cela permet de visiter facilement et l'injection des ovocytes sélectionnés.
Note: Le processus d'injection entier devrait prendre moins de 10 secondes quand il est exécuté correctement. Vaste coup de poignard ou s'attarder à l'intérieur de l'aiguille d'ovocytes se traduira par de graves dommages à la chambre de l'œuf.
Remarque: Si une erreur est commise lors de l'injection, passer à la suivante a été marquée ovocyte. Ne perdez pas de temps sur les ovocytes endommagés.
Remarque: L'aiguille peut être obstrué lors d'une séance d'injection. Dans ce cas, déplacer l'aiguille adjacente à la pièce cassée de verre dans de l'huile sur la lamelle. Esprith, le verre et l'aiguille dans le même plan focal, doucement enfoncent l'aiguille dans le verre (Figure 6H). Vérifiez que l'aiguille est débloquée en appuyant sur le bouton d'injection et de voir si du liquide sort de la pointe de l'aiguille.
Remarque: Si une longue période de temps s'est écoulé entre l'œuf et chambre d'isolement d'injection d'ovocytes, les ovocytes sera difficile à injecter et présentent des modifications phénotypiques liées au stress. Des questions similaires peuvent se produire à la manipulation grossière de l'ovocyte ou l'injection de volumes excédentaires (comparer les figures 6I, J, K).
7. Live conception d'imagerie expérimentale
8. Les résultats représentatifs
In vitro synthétisé Alexa-546 grk ARN injecté dans un oeuf Me31B :: GFP chambre (figure 7A). L'ARN se localise dans la partie antérieure dorsale de l'ovocyte et forme un bouchon autour du noyau (figure 7B). Pour plus d'exemples de la localisation d'ARN voir MacDougall N., et al. (2003) 11.
Ovocytes stade moyen et tardif exprimant la protéine fluorescente marquée (Tau-GFP, figure 7C) ou des systèmes de marquage d'ARN (GRK * mCherry, figure 7D) peuvent être visualisés sans injection.
Figure 1.
Figure 2.
Figure 3.
Figure 4.
Figure 5.
Figure 6.
Figure 7.
Imagerie des cellules vivantes est un test puissant pour l'examen des processus cellulaires en temps réel. En plus de l'observation simple champ lumineux, l'ajout de marqueurs fluorescents pour les protéines et les ARN d'intérêt a conduit à de nombreuses percées. Ici, nous avons établi un protocole pour les ovocytes d'imagerie de vie individuels qui peuvent être utilisés en combinaison avec des tests génétiques et biochimiques.
Dans ce protocole, nous expliquent également comment manipuler expérimentalement ovocytes de vie par injection. Il existe de nombreuses possibilités pour le matériel à injecter, y compris in vitro synthétisé fluorescentes ARN marqué pour le dosage de la capacité d'une structure secondaire de l'ARN de localisation directe (Ball et Davis, non publié) et des anticorps qui inhibent la fonction des protéines 6. Les travaux futurs seront probablement voir l'introduction d'éléments d'étiquetage et d'autres machinerie cellulaire des ovocytes de vie permettant mécanismes moléculaires à tester.
t "> Préserver la viabilité et la santé du tissu est essentielle lorsque l'on travaille avec des cellules vivantes. Dans ce protocole, nous signalons un certain nombre d'étapes qui peuvent conduire au stress de la chambre de l'œuf. Par exemple, en dépit de l'huile étant supérieure à l'imagerie, culture étendue dans l'huile peut conduire à insister sur la chambre de l'œuf. Ceci peut être facilement surveillés en vertu de l'exposition aux champs lumineux en examinant la morphologie nucléaire et de la position, membrane ovocytaire qui déforment et bulle sous contrainte (Figure 7E comparer (sans contrainte) à Figure7F ( souligné)). Stade 9 chambres d'oeufs montrent la localisation de l'ARN et la migration des cellules frontière 12 sur plusieurs heures. Cependant, une étape 7/8 chambre œuf commencent à présenter des effets néfastes à l'huile de carbone halo après environ 40 minutes de l'ovaire est retiré de la femmes. tardives chambres oeufs de stade, le stade de 11 à 14, peut se développer normalement dans de l'huile ou un milieu aqueux en raison de la sécrétion de la coquille de l'oeuf à partir des cellules folliculaires à ces 13 étapes. Il a été reported que l'ajout de l'insuline à moyen insectes aqueuse peut maintenir scène 9 ovocytes pour un maximum de 6 heures 14 et germaria jusqu'à 14 heures 15. Dans tous les cas, une manoeuvre agressive de la chambre de l'œuf doit être évitée, car elle met l'accent sur les ovocytes et réduit sa viabilité. Imagerie moins chambres d'oeufs et prenant soin de traiter chacun d'eux est doucement la meilleure façon d'assurer une viabilité optimale.Nous n'avons rien à communiquer.
Ce travail a été soutenu par une bourse du Wellcome Trust Senior Research à I. Davis.
Les outils utilisés dans la dissection doit être propre, mais n'ont pas besoin d'être autoclavés. Essuyez les outils avec de l'EtOH et laissez-les sécher avant de commencer.
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Appareil d'injection | Tritech Research, Inc 2961, avenue des anciens combattants Los Angeles, CA 90064 | Minj-1 | Mise à jour avec un support pour prendre Eppendorf Femptotips |
Aiguille d'injection | Eppendorf stérile Femtotips I et II | 930000043 | Différents conseils sont meilleurs pour différentes applications |
Chargement des conseils 20 pi | Eppendorf | 5242956.003 | |
Levure sèche active | Fleischmann Yeast | # 2192 |
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