Création transitoires pores de la membrane cellulaire à l'aide d'une imprimante jet d'encre standard

Résumé

Une description des méthodes utilisées pour convertir un HP DeskJet 500 imprimante dans un bioprinter. L'imprimante est capable de traiter les cellules vivantes, ce qui provoque des pores transitoires dans la membrane. Ces pores peuvent être utilisés pour incorporer de petites molécules, dont fluorescente G-actine, les imprimés dans les cellules.

Résumé

Bioprinting a une large gamme d'applications et de l'importance, y compris l'ingénierie tissulaire, directs thérapies cellulaires d'application, et la microfabrication biocapteur. ^1-10 Récemment, l'impression jet d'encre thermique a également été utilisé pour la transfection génique. ^8,9 Le processus d'impression thermique à jet d'encre a été démontré que perturber temporairement les membranes cellulaires sans affecter la viabilité des cellules. Les pores transitoires dans la membrane peut être utilisée pour introduire des molécules, ce qui, autrement, seraient trop grands pour passer à travers la membrane, dans le cytoplasme de la cellule. ^8,9,11

L'application en cours a démontré ici est l'utilisation de l'impression jet d'encre thermique pour l'incorporation de marqueurs fluorescents g-actine monomères dans les cellules. L'avantage d'utiliser d'encre thermique à jet d'encre à injecter des molécules dans les cellules, c'est que la technique est relativement bénigne pour les cellules. ^{8, 12} viabilité des cellules après l'impression a été similaire à celle de la cellule standard de plaméthodes Ting ^1,8. En outre, l'impression jet d'encre peut traiter des milliers de cellules en quelques minutes, ce qui est beaucoup plus rapide que la micro-injection manuelle. Les pores créés par l'impression a été démontré que de fermer pendant environ deux heures. Cependant, il ya une limite à la taille du pore créé (~ 10 nm) avec cette technique d'impression, ce qui limite la technique d'injection de cellules avec des petites protéines et / ou des particules. ^8,9,11

Une norme imprimante HP DeskJet 500 a été modifié pour permettre l'impression des cellules. ^{3, 5, 8} Le capot de l'imprimante a été retiré et le mécanisme d'alimentation du papier a été contourné en utilisant un levier mécanique. Une étape a été créé pour permettre le placement de lames de microscope et lamelles directement sous la tête d'impression. Cartouches d'encre ont été ouverts, l'encre a été enlevé et ils ont été nettoyés avant de les utiliser avec des cellules. Le motif d'impression a été créée en utilisant un logiciel de dessin standard, qui a ensuite contrôlé l'imprimante via une commande d'impression simple. 3T3 fibroblastes ont été cultivés jusqu'à la confluence, la trypsine, puis remis en suspension dans du tampon phosphate salin avec solubles marquées par fluorescence g-actine monomères. La suspension cellulaire a été introduit à la pipette dans la cartouche d'encre et de lignées de cellules ont été imprimés sur des lamelles de verre de microscope de couverture. Les cellules vivantes ont été imagées par microscopie à fluorescence et de l'actine a été trouvé dans le cytoplasme. Incorporation de l'actine fluorescente dans la cellule permet l'imagerie de courte durée la dynamique du cytosquelette et est utile pour un large éventail d'applications ^13-15.

Protocole

1. Conversion de la HP DeskJet 500

Il convient de noter que cette technique devrait travailler avec de nombreux commercialement imprimantes jet d'encre. Toutefois, des imprimantes plus anciennes ont tendance à mieux fonctionner, car ils utilisent des cartouches d'encre avec des buses de diamètre plus grand, qui ne se bouchent pas aussi facilement. En outre, des imprimantes plus anciennes ont tendance à utiliser des capteurs mécaniques d'alimentation papier qui sont plus faciles à contourner. Imprimantes avec des capteurs optiques peut être trompé, mais en utilisant une petite bande de papier sur le bord le plus éloigné de l'imprimante lors de chaque cycle, mais c'est un peu plus difficile que le système mécanique de "truc". Les imprimantes actuellement disponibles dans le commerce qui fonctionnent le mieux sont en basse résolution (DPI).

Imprimantes de résolution élevé ont tendance à obstruer plus facilement. La résolution de l'imprimante HP Deskjet 500 est de 300 DPI. Il existe de nombreuses imprimantes disponibles dans le commerce (HP Deskjet série et d'autres) qui ont une résolution de 600 DPI. Ce type d'imprimante peut être utilisé avec seulement une légère augmentation dans la busecolmatage des questions qui peuvent être allégés en utilisant un nettoyage soigneux (section 3).

1. Retirer le boîtier supérieur en plastique de l'imprimante, en libérant plusieurs clips en plastique à partir de la base inférieure de l'imprimante et lentement la levée de l'arrêt en haut.
2. Dévissez la lumière panneau de boutons / affichage du haut de l'imprimante, le laisser branché à la carte mère de l'imprimante.
3. Nettoyer l'intérieur de l'imprimante, en particulier les zones où la cartouche d'encre repose et où se produit l'impression.
4. Repérez les câbles alimentant les mécanismes d'alimentation du papier et de les débrancher de la carte mère.
   1. Dans la HP DeskJet 500, ceux-ci se trouvent juste en dessous du bac à papier vers la gauche de l'avant.
5. Localiser mécanisme de détection du papier. Contourner le mécanisme de fixation par une chaîne ou boucle de fil pour servir de poignée de traction manuelle.
   1. Dans le HP DeskJet 500, le mécanisme de détection du papier est un levier plastique gris trouve au-dessus et derrière le mécanisme d'alimentation d'impression / papier.
6. Créer une scène devant le mécanisme d'alimentation en papier (où le papier serait alimenté à partir et déposé) afin d'amener les lames d'impression désirées à un niveau juste au-dessous de la tête d'impression de la cartouche.
   1. Pour nos expériences, le titulaire expédition en mousse pour tubes de 15 ml à centrifuger a été utilisé avec des lames de microscope plusieurs collées en place dans la zone d'impression pour amener le niveau final des diapositives à la hauteur désirée.
7. Afin de maintenir une technique aseptique, l'imprimante peut être placé dans une armoire standard de biohazard ou hotte à flux laminaire de table.
8. Il est important de noter que la modification d'un commerce à jet d'encre d'imprimante sont généralement annulera la garantie constructeur de l'imprimante.

2. Conversion cartouches d'encre HP (Stock HP 26 cartouche d'encre noire)

1. Retirez la cartouche de son emballage, laissant la bande de protection couvrant les contacts de l'imprimante et tête d'impression pour le moment.
2. Stabiliser le corpsde la cartouche (partie noire), soit avec une pince ou un étau (tout simplement saisir fermement la cartouche à la main habituellement travaillées ainsi), laissant le vert clair dessus de tout obstacle.
3. En utilisant des pinces ou une clé ajustable, saisir le sommet vert de la cartouche et tourner d'avant en arrière plusieurs fois jusqu'à ce qu'elle se libère.
   1. Cela ne devrait pas prendre beaucoup de force, mais le haut n'est plus nécessaire, il est donc correct si il se casse lorsque vous le retirez.
4. En utilisant un tournevis, un levier hors de la pièce en plastique transparent maintenant exposée.
   1. Encore une fois, cela ne devrait pas prendre beaucoup de force, mais il ne sera pas nécessaire, il est donc correct si il se casse lors de l'enlèvement.
5. Videz tout en restant dans le réservoir.
6. Retirer le ruban protecteur de plastique recouvrant les contacts de l'imprimante et tête d'impression.
7. Rincez soigneusement les réservoirs avec de l'eau.
   1. Utilisation d'une pipette ou la seringue pour pousser l'eau à travers les canaux.
   2. L'eau sera probablement fuir de la tête d'impression pendantce processus, ce qui est acceptable, et ne causent aucun dommage à la fonctionnalité de la cartouche.
8. Lorsque l'eau soit claire, que la cartouche de sécher.

3. Nettoyage cartouche d'encre

1. Afin de maintenir un environnement d'impression propre, la cartouche d'encre doivent être nettoyés avant et après utilisation.
   1. Cela permet aussi d'éviter avec la cristallisation des sels et autre matériel biologique dans la cartouche qui pourrait provoquer des blocages.
2. Entièrement plonger la cartouche dans un bécher rempli d'eau déminéralisée, et sonication pendant 15 minutes avant et après l'impression.
3. Après sonication, retirez la cartouche de l'eau, et secouer l'excédent d'eau.
4. Vaporiser l'éthanol à 70% dans la cartouche pour créer un environnement plus aseptique.
   1. Assurez-vous que l'éthanol a séché avant d'ajouter la solution d'impression bioink.

4. Faire Suspension Cell - «Biol'encre "

1. Des cellules en culture avant d'être prêt au passage.
   1. Pour les fibroblastes 3T3: les cellules de semences sur flacons T-75 à environ 1.3x10 ⁴ cellules / cm ² dans Dulbeccos Eagles Medium mise à jour (DMEM) avec 10% sérum de veau foetal (FBS). Cellules de culture pour deux jours dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Faire fluorescente solution mère g-actine à une concentration 50 pg / ml dans une solution tampon phosphate (PBS).
3. Au passage des cellules.
   1. Pour les fibroblastes 3T3: Retirez le support de flacon et rincer deux fois avec du PBS. Couvrir les cellules avec 5 ml de trypsine 0,25% + EDTA et incuber pendant 5 minutes.
   2. Ajouter 5 ml de milieu frais et pipeter la suspension de cellules dans un tube de 15 ml à centrifuger conique et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. Aspirer passé à moyen terme.
4. Remettre en suspension les cellules dans du PBS avec une solution fluorescente stocks g-actine pour créer bioink.
   1. Bioink doit avoir une concentration finale de g-actine de 10 ug / ml et une coopération cellulairencentration de 1x10 ⁵ cellules / ml. Cette concentration a été optimisée pour limiter la quantité de cellules par goutte et le colmatage de la tête d'impression ^8.
   2. Notez que 250 pi de bioink imprime trois lamelles avec le modèle illustré à la figure 2.

5. Bioprinting

1. Mise en marche et laisser l'imprimante se réchauffer.
2. Endroit désiré surface d'impression (ici, on utilise 22 mm x 22 mm lamelles) sur le centre de la scène préparée à l'étape 1.6.
3. Créer un fichier de signatures de l'impression.
   1. Ouvrez Microsoft Word (ou tout autre logiciel de dessin), et dessiner le motif désiré.
   2. Choisissez un modèle d'impression souhaitée pour l'impression de cellules dans le fichier premade.
4. Chargez la cartouche préparée avec suspension cellulaire désirée.
   1. La suspension de la pipette dans la circulaire de petits puits au fond du compartiment de la cartouche. Utilisez environ 100-120 ul de la solution. La taille des gouttes imprimés est d'environ 130picolitres. ⁸
5. Imprimer le fichier avec l'imprimante HP Deskjet 500 Imprimante.
   1. Pour de meilleurs résultats, imprimez les petits modèles à plusieurs reprises (5), en changeant le nombre de copies souhaitées dans le programme de traitement de texte.
6. L'imprimante se réchauffer de nouveau, puis la cartouche se déplace vers la "position d'attente".
7. Lorsque la cartouche se déplace dans la position d'attente (un peu à gauche de la goutte d'encre bien au-dessous et y reste), tirez sur le fil mécanisme d'alimentation papier et l'impression doit commencer.
   1. Pour obtenir des exemplaires multiples de l'impression, le mécanisme d'alimentation papier devront être remis en liberté après chaque cycle ou une page imprimée. La cartouche sera ensuite revenir à la position "prête", et le fil mécanisme d'alimentation papier doit être soulevée à nouveau.
8. L'imprimante permet d'imprimer sur la lamelle placée au centre de l'étape d'impression à l'étape 5.2 (voir Figure 2).

6. Résultats représentatifs

Les résultats représentatifs de l'ensemble de processus de conversion d'une norme, Deskjet hors du plateau-HP 500, standard cartouches HP de la série 26 va créer une imprimante avec la capacité d'imprimer des solutions cellulaires pour de nombreux types d'analyse comme indiqué précédemment. L'imprimante terminée après la conversion est représentée sur la figure 3, avec un étage d'impression afin de placer le couvercle de microscope sur glissement. L'imprimante peut être utile dans l'analyse dans de nombreux domaines, y compris mais non limité à: la mécanique des cellules simples, l'ingénierie tissulaire, transfection génique, micromodelage biocapteur et thérapies cellulaires directs ^{1-10, 16-22.}

Dans cet exemple, une imprimante HP Deskjet 500 imprimante HP et 26 cartouches d'encre de la série ont été modifiés pour bioprinting. En utilisant cette installation imprimante avec un bioink constituée d'une suspension cellulaire de fibroblastes dans une solution de monomère g-actine, les cellules ont été imprimés sur des lamelles de microscope en verre. La figure 1 illustre la chose représentatives PHP sous de cellules de fibroblastes imprimés, qui montrent incorporés monomères d'actine fluorescente. Les résultats ont été obtenus dans un environnement contrôlé aseptique dans lequel les cellules ont été imprimés dans des modèles personnalisables.

Le modèle utilisé dans cet exemple a été créé dans Microsoft Word (Figure 2). Ce modèle a créé une ligne continue de la solution d'impression à travers la majorité de la lame de microscope. La figure 4 montre la ligne droite dans laquelle le bioink et les cellules sont mutuellement déposé. Il convient de noter que, immédiatement après l'impression, il ya une augmentation de la fluorescence de fond parce que la solution bioink, dans lequel les cellules sont suspendues, contient libres excédentaires monomères d'actine fluorescente. Cette fluorescence de fond diminue sensiblement après l'addition de milieu de croissance sur les cellules (figure 1), qui lave monomère excédentaire du substrat.

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Figure 1. Des images représentatives de fibroblastes 3T3 3 heures après l'impression en utilisant l'imprimante jet d'encre modifiées. L'intérieur des cellules montrent incorporés monomères d'actine marquées par fluorescence. Barres d'échelle représentent 50 um.

Figure 2. De conception utilisées pour imprimer bioink.

Figure 3. Imprimante après la conversion avec le stade de styromousse. Le fil orange au milieu contourne le capteur de levier d'alimentation papier.

Figure 4. L'image représentant des fibroblastes 3T3 imprimés dans une zone d'impression localisée. Image en microscopie pris 5 minutes après l'impression à un grossissement de 20x.

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Figure 5. Image de fluorescence (grossissement 40x) pris 3 heures après l'impression montrant un fibroblaste avec intériorisées monomères d'actine fluorescente. La barre d'échelle représente 50 um.

Figure 6. Microscopie fluorescente (20x) de prise d'une cellule 15 minutes après l'impression. L'image montre à la fois g-actine (vert) et le noyau (en bleu). De gauche à droite: g-actine avec Alexa Fluor 488, noyau avec DAPI, et une superposition des deux.

Figure 7. Microscopie à fluorescence montrant deux fibroblastes dans un modèle de ligne 3 heures après l'impression. Image à gauche montre monomères d'actine marqués par fluorescence à l'intérieur des cellules. Image sur la droite est une superposition du canal fluorescent avec l'image de fond pour montrer que, bien queil peut y avoir des débris sur la diapositive (en bas à gauche), il ne montre aucune fluorescence. Barres d'échelle représentent 50 um si la taille n'est pas indiquée à l'extrême droite est un groupe de contrôle de non-imprimés cellules incubées pendant 3 heures avec des monomères marquées par fluorescence. Ce contrôle est de montrer que les monomères ne pouvaient pas pénétrer la membrane cellulaire sans perméabilisation de la membrane cellulaire par l'impression.

Discussion

Le processus de conversion d'une imprimante jet d'encre standard de bureau pour bioprinting n'est pas particulièrement difficile. L'étape la plus difficile est de déterminer la façon de contourner le mécanisme d'alimentation papier, ce qui dépend de la marque et le modèle d'imprimante utilisé. Cependant, cela est relativement simple, lorsque le capteur d'alimentation du papier est mécanique comme décrit ici. Pour les modèles dotés de capteurs optiques d'alimentation, d'autres techniques peuvent avoir besoin d'être employé pour tromper l'imprimante en pensant qu'il est l'utilisation de papier; par exemple, on peut exécuter un petit morceau de papier dans l'imprimante alors qu'il imprime sur la lame de microscope. Contourner le mécanisme d'alimentation papier est susceptible d'être l'étape la plus difficile dans l'application de ces procédures à différents modèles d'imprimantes.

Lorsque la construction d'un stade de tenir les lamelles pour l'impression, il est important de veiller à un bon alignement et la hauteur. L'étape devrait permettre la lamelle pour être placé au milieu de la zone d'impression. En outre, il devrait plAs de la lamelle à une hauteur suffisante pour permettre le dégagement de la cartouche d'impression de passer sur la lame sans la perturber. La hauteur exacte de la scène va dépendre du modèle d'imprimante.

Afin de s'assurer que les cellules imprimées ne soient pas emportés, les lames ont été placées dans un incubateur immédiatement après l'impression pendant environ 30 minutes pour permettre la fixation des cellules, avant d'autres milieux de croissance cellulaire a été ajouté. Parce que les cellules ont été imprimés dans une solution qui comprend de grandes quantités de STP, les cellules ne se dessèche pas et reste viable. Les cellules ont été imagées par microscopie à fluorescence pour visualiser la distribution des tags g-actine monomères à l'intérieur de la cellule (figures 1, 5-7). Lors de l'impression avec des fibroblastes 3T3, La figure 5 montre un résultat représentatif, avec l'actine provoquant une grande partie de la cellule à fluorescence, mais aussi de promouvoir des lignes de luminosité accrue. L'incorporation de fluorescence marqué g-actine dans le cytosquelette estutile pour l'étude de la dynamique du cytosquelette et de la mécanique cellulaire. ^12-15 Une limitation de cette technique est qu'elle est applicable uniquement pour les molécules et les protéines qui ont des diamètres inférieurs à environ 10 nm.

Pour s'assurer que les cellules ont été effectivement traités par l'imprimante convertis, DAPI (1:5000 dans du PBS) a été ajouté à la bioink à la place de la moitié du volume de la pure PBS. Le DAPI colorant fluorescent se lie à des parties d'acides aminés riches d'ADN se trouvent dans le noyau. Par conséquent DAPI est une tache utile dans les noyaux d'imagerie par fluorescence des cellules imprimées. La figure 6 montre une image représentative d'une cellule affichant à la fois Alexa Fluor 488 (actine) et DAPI (noyau) de fluorescence avec une image de superposition des deux. La figure 7 illustre également comment les cellules fluorescentes fois les monomères g-actine ont été intégrées tandis que les non-matériel biologique qui a été déposé dans l'échantillon ne sera pas à cause de la fluorescence absence de la g-actine monomères.

Une considération importante pour bioprinting sont les milieux aqueux utilisés pour la bioink. Il a été constaté que l'utilisation de supports standard de croissance des cellules avec du sérum ont donné des résultats contradictoires. Ceci est probablement dû à l'obstruction des buses d'impression-tête par des protéines sériques. L'utilisation de PBS augmenté la consistance de motifs imprimés et le nombre de cellules déposée. Un inconvénient à l'utilisation de PBS est que les cellules ne doivent pas être laissés dans la suspension pendant de longues périodes de temps. Toutefois, les fibroblastes dans ces exemples ont été en mesure de tolérer les conditions bioink pour au moins une heure avec aucun changement dans la viabilité des cellules. Ceci est cohérent avec plusieurs constatations antérieures, qui indiquent que les cellules imprimées via des mécanismes à jet d'encre thermiques ont montré des taux de viabilité élevés. ^2-8

Cette configuration de l'imprimante modifié peut être utilisé pour des applications autres que l'impression de cellules. ^16-22 protéines de la matrice, comme le collagène ou rigide plastifiéCTIN, peuvent être facilement imprimés sur des substrats avec cette technique, qui peut être utile pour un patron de cellules. Pour le collagène de type, par exemple, I imprimée en motifs de ligne entraîne substrats de collagène alignés qui peuvent être utilisés pour des études in vitro de culture cellulaire. ¹⁷ En plus de protéines de la matrice, d'autres molécules, dont les facteurs de croissance, de façon fiable localisée sur des substrats pour des études cellulaires et des applications thérapeutiques potentielles. ¹⁸

Une limitation importante de la conception décrite dans les étapes ci-dessus, c'est que cette imprimante n'est pas capable d'imprimer en plus d'une dimension. Cela limite le potentiel d'utilisation dans des applications telles que l'impression à motifs échafaud. Pour permettre l'impression en 3D, une étape spécialisée doit être utilisé. Le stade doit avoir des réglages en hauteur supplémentaires pour la couche-par-couche de dépôt de bioink.

Bioprinting a montré des résultats prometteurs comme une méthode efficace et rentable pour l'ingénierie tissulaire, Le gène de transfection, micromodelage et une micropuce de fabrication ^{1-12, 16-22} Les applications futures de ce type de dispositif sont nombreux, y compris:. Création d'contrôlées et motifs microenvironnements cellulaires, l'incorporation de macromolécules dans le cytoplasme de la cellule et le dépôt de cellules sur des échafaudages et des structures qui ne se produisent pas naturellement ou de manière efficace.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Retiré du fabricant. Acheté rénové décembre Trader.
HP 26 Cartouche d'encre noire	Hewlett-Packard	51626A
Actine de muscle de lapin, Alexa Fluor 488 conjugué, 200 ug	Invitrogen	A12373
Tampon phosphate salin (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos Eagles mise à jour (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich	F4135
L'amphotéricine B	Sigma-Aldrich	A2942	Utilisé à 0,5% en milieu de culture cellulaire
La pénicilline-streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333	Utilisé à 0,5% en milieu de culture cellulaire
Banc de débit unidirectionnel Clean	Envirco	VLF 797	Le logement en option pour garder l'imprimante aseptique