Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

Résumé

La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d'une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l'ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l'activité sur le transport inverse de la dopamine.

Résumé

Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques par l'intermédiaire de ses objectifs pré-et post-synaptique ^1. Le signal de la dopamine se termine par la diffusion de ^2-3, enzymes extracellulaires ⁴ et transporteurs membranaires ^5. Le transporteur de la dopamine, située dans la fente péri-synaptique des neurones dopaminergiques efface les amines libérées par un flux entrant de dopamine (absorption). Le transporteur de la dopamine peut aussi fonctionner dans le sens inverse pour libérer des amines de l'intérieur vers l'extérieur dans un processus appelé transport vers l'extérieur ou l'efflux de dopamine ^5. . Plus de 20 ans, Sulzer et al ont rapporté le transporteur de la dopamine peut fonctionner en deux modes d'activité: avant (absorption) et inverse (efflux) ^5. Le neurotransmetteur libéré par efflux par le transporteur peut transporter une grande quantité de dopamine dans l'espace extracellulaire, et il a été montré à jouer un rôle majeur dans la régulation extracellulaire de dopamine homeostasis ^6. Nous décrivons ici comment patch-clamp et l'enregistrement simultanés ampérométrie peut être utilisé pour mesurer la dopamine libérée par l'intermédiaire du mécanisme d'efflux avec une résolution temporelle millisecondes lorsque le potentiel de la membrane est contrôlée. Pour cela, l'ensemble de la cellule courante et à l'oxydation (ampérométrique) signaux sont mesurés simultanément en utilisant un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, avec un ensemble de Bessel passe-bas du filtre à 1.000 Hz pour l'ensemble des cellules d'enregistrement en cours). Pour l'enregistrement d'une électrode ampérométrique fibre de carbone est reliée à un second amplificateur (200B Axopatch) et est placé à côté de la membrane plasmique et maintenu à +700 mV. Les cellules entières et à l'oxydation (ampérométrique) courants peuvent être enregistrées et la relation courant-tension peut être généré à l'aide d'un protocole échelon de tension. Contrairement à l'étalonnage d'habitude ampérométrique, qui exige la conversion de la concentration, le courant est directement signalé sans tenir compte de la ^{7 fois le} volume efficace. Ainsi, les données qui en résultentreprésentent une limite inférieure à efflux de dopamine parce que certains émetteur est perdu à la solution en vrac.

Protocole

1. Matériel et fournitures

1. Monter une cage de Faraday sur le dessus de la table anti-vibration (TMI) pour diminuer le bruit de fond.
2. La pince simultanée correctif d'enregistrement ampérométrie système nécessite un microscope inversé avec d'excellentes optiques DIC et une lentille longue distance de travail. Branchez le microscope phare à une batterie de voiture. Cette source de lumière continue pour le système va encore réduire le bruit électrique.
3. Micromanipulateurs hydrauliques (Siskiyou) diminution supplémentaire du bruit. Dans notre configuration, nous utilisons un manipulateur droitier pour l'enregistrement de cellules entières, et le gaucher pour ampérométrie.

2. Préparer électrodes pour l'enregistrement

1. Tirez électrodes de patch en utilisant les pipettes de quartz sur un extracteur P-2000 (Sutter). Notre traction dure environ 5 secondes, avec deux cycles thermiques. Cette fois, la chaleur a provoqué une résistance constante (3-4 MQ) dans nos pipettes de patch ensemble de cellules.
2. Remplir l'électrode avec l'solution de la pipette contenant 2 mM de dopamine et le monter sur le manipulateur droit. Envelopper le tube contenant la solution contenant DA pipette avec une feuille d'aluminium. Garder sur la glace. La dopamine est oxydable. Garder la solution sur de la glace, à l'abri de la lumière diminue le taux d'oxydation de la dopamine.
3. Retirez délicatement un ProCFE (Dagan) électrode basse en fibre de carbone ampérométrique de bruit à partir de la boîte de remisage, remplir avec du mercure, montage sur l'adaptateur ampérométrique (comme le montre la figure 1), puis monter sur le maniupulator droite. Protéger la pointe de la fibre de carbone contre les dommages en maintenant l'extrémité de la fibre de carbone. Vérifiez l'électrode avec un microscope de laboratoire pour garantir la pointe est propre et intacte.
4. Examiner l'intégrité de l'électrode ampérométrique en mettant l'électrode dans une boîte de Petri en verre contenant une solution de fond externe. Enregistrer un courant de référence en l'absence de la dopamine. Ajouter 10 ul d'une solution 1 mM DA au plat. Une nouvelle électrode ampérométrique bonnecâblés d'une augmentation du courant d'oxydation. Répétez cette étape au début et à la fin de chaque expérience afin de s'assurer de l'électrode ampérométrique fonctionne correctement.

3. Préparer la culture primaire de neurones à dopamine des neurones ou des cellules modifiées génétiquement pour exprimer transporteur de la dopamine dans les plats de Pétri en verre de fond

1. Lavez délicatement les cellules appelées neurones dopaminergiques trois fois avec une solution externe au chaud.
2. Monter le fond en verre de Pétri sur la platine du microscope.

4. Visualisez cellulaire et exécuter l'expérience

1. Trouver le bon point focal de visualiser clairement les cellules. Exercer une pression positive sur l'électrode de patch. Ensuite, amener doucement vers le bas les deux électrodes dans la solution, et à proximité de la cellule.
2. Positionner l'électrode ampérométrique à côté de la cellule (à gauche), et l'électrode de patch sur la droite.
3. Réaliser un joint d'étanchéité gigaohm sur la cellule de l'électrode de patch. La rupture du joint avec aspirationatteindre configuration cellule entière.
4. Permettre 5-8 min pour la dialyse de la solution interne contenant la dopamine dans la cellule.
5. Utiliser désiré échelon de tension ou d'un protocole de rampe. Acquérir simultanément les données provenant à la fois de la pipette de patch et l'électrode ampérométrique pour mesurer les courants de cellules entières et inverser le transport de la dopamine par le transporteur de la dopamine tandis que le potentiel de la membrane est contrôlée par l'intermédiaire de la pipette de patch.

Résultats

Patch-clamp combinée avec ampérométrie peut mesurer la tension en fonction de DAT DA induite par efflux. Figure 2A montre une configuration représentative expérimentale et l'enregistrement des DAT DA induite par efflux lorsque le milieu intracellulaire et le potentiel de membrane sont serrées par une pipette de patch de cellule entière. En utilisant cette technique, les cellules exprimant les protéines YFP-DAT sont serrées en tension avec une pipette de patch pendant toute cellule d'une...

Discussion

Simultanée voltage-clamp et ampérométrie présente les avantages suivants. Tous les types de cellules sont accessibles et peuvent être utilisés pour l'enregistrement. L'identification des cellules ou neurones où les enregistrements sont effectués est simple et direct. En particulier, si la cellule est marquée par fluorescence par addition d'un marqueur fluorescent pour la protéine d'intérêt à l'expérimentateur peut facilement sélectionner la cellule cible ou des neurones. La configurati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Équipement
Anti-vibration table w / cage de Faraday	Technique Manufacturing Corporation	63-500 série	nous utilisons le modèle 63-543
Microscope inversé Nikon TE-2000	Nikon	interrompu	maintenant Eclipse Ti
Deux amplificateurs à faible bruit Axopatch 200B	Molecular Devices		800-635-5577
1-203 CV headstage BU	Molecular Devices		800-635-5578
HL-1-U porte-pipette	Molecular Devices		800-635-5579
Digidata 1440A convertisseur A / N	Molecular Devices		800-635-5580
Deux manipulateurs Siskyou, gaucheet droitier	Siskiyou	MX6600R MX6600L	877-313-6418
Laser pipette extracteur	Sutter Instruments	P-2000	888-883-0128
Faible bruit de fibres de carbone électrode ampérométrique	ProCFE		www.dagan.com
Faible bruit de quartz pipette	Sutter Instruments	QF100-70-7.5	888-883-0128
Batterie de voiture de 12 volts			largement disponibles
Chargeur de batterie de voiture			largement disponibles
			Réactif
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma	S7653
HEPES	Sigma	H3375
Dextrose	Sigma	G7528
Le sulfate de magnésium (MgSO 4)	Sigma	M2643
Phosphate de potassium monobasique (KH 2 PO 4)	Sigma	P5655
Le chlorure de potassium (KCl)	Sigma	P9333
Dihydrate de chlorure de calcium (CaCl 2 • 2H 2 0)	Sigma	223506
Hexahydrate de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 0)	Sigma	M2670
EGTA	Sigma	E0396