Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l'identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Résumé

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Résumé

Ce protocole décrit une microscope à fluorescence sur le dépistage des plants d'Arabidopsis et décrit comment cartographier des mutations récessives qui modifient la distribution subcellulaire d'un marqueur fluorescent spécifique marqué dans la voie de sécrétion. Arabidopsis est un puissant modèle biologique pour les études génétiques en raison de sa taille du génome, temps de génération, et la conservation des mécanismes moléculaires chez les royaumes. Le tableau génotypage comme une approche à la carte de la mutation en alternative à la méthode traditionnelle basée sur des marqueurs moléculaires est avantageuse car elle est relativement rapide et peut permettre à la cartographie de plusieurs mutants dans un laps de temps très court. Cette méthode permet l'identification des protéines qui peuvent influer sur l'intégrité de tout organite dans les plantes. Ici, comme un exemple, nous proposons un écran pour cartographier les gènes importants pour l'intégrité du réticulum endoplasmique (RE). Notre approche, toutefois, peut être facilement étendu à d'autres organites des cellules végétales(Voir par exemple ^1,2), et représente donc une étape importante vers la compréhension de la base moléculaire qui régit d'autres structures subcellulaires.

Protocole

1. EMS traitement

Graines d'Arabidopsis thaliana sont mutagenèse utilisant comme agent de mutagène méthanesulfonate d'éthyle (EMS) ^3,4, ce qui induit dans le génome de C-à-T changements qui en résultent en C / G à T / A mutations ^5-7.

1. Peser 0,8 g de graines d'Arabidopsis (~ 40,000 graines) portant le marqueur fluorescent organite (plus précisément, dans cette étude ssGFPHDEL (séquence signal-GFP-HDEL tétrapeptide) a été utilisée comme un marqueur ER).
2. Transférer les graines dans un tube de 50 ml faucon, puis ajouter 25 ml d'eau distillée.
3. Ajouter 0,2% (v / v) méthanesulfonate d'éthyle.
4. Incuber pendant 16 heures sur nutation mélangeur à basse vitesse.
5. Aspirer le liquide et jetez-le dans un flacon contenant 1,0 M de NaOH pour inactiver l'EMS.
6. Ajouter 25 ml d'eau dans le tube Falcon contenant les graines, à proximité, et inverser 5 fois pour se laver les graines et attendre jusqu'à ce que toutes les graines se sont installés, puis aspirer l'eau et jetez dans la Na 1,0 M OH ballon.
7. Répétez l'étape de lavage jusqu'à 10 fois.
8. Après le lavage final, remettre en suspension les graines dans une quantité minimale d'eau.
9. Passez à la stérilisation des semences en ajoutant 25 ml d'eau de Javel à 10%, agiter vigoureusement pendant 30 s. Laissez les graines se déposent au fond, versez l'eau de Javel et rincer avec 25 mL d'eau stérile. Décanter l'eau stérile et ajouter 25 ml d'éthanol 70%. Agiter les tubes pendant 30 s. Laissez les graines se déposent au fond. Décanter l'éthanol et rincer avec 25 mL d'eau stérile. Répéter deux fois le lavage à l'eau stérile, puis versez les graines dans un plat de Petri en plastique contenant 3 mm de papier filtre et laisser sécher sous le capot. Conserver à 4 ° C pendant 2 jours.
10. Plaque des graines sur ½ MS Phytagel (concentration de la moitié de milieu de Murashige et Skoog), de 150 mm boîte de Pétri (environ 250-300 graines pour la plaque).
11. Cultiver des graines M1 sur la plaque pendant 2 semaines, puis transplanter dans le sol.
12. Ramassez les graines M2 à partir de plantes individuelles pour générer des lignes M1 M2 (1000 lignes indépendantes).

ove_title "> 2. dépistage confocale des populations M2 et M3

Dans cette section, nous décrivons l'observation des plants avec un microscope confocal ou de fluorescence, comme décrit précédemment ^8.

1. Soixante graines de chaque ligne M2 sont cultivés pendant 7 à 10 jours sur des boîtes de Pétri en plastique, ½ MS Phytagel; sur la même plaque sont également cultivés 5 plants EMS-non traité (témoin).
2. Cinq à dix cotylédons sont montés avec le côté abaxial vers l'objectif (40X) sur une lame de microscope et clos, avec une lamelle.
3. Chaque cotylédon est observé, à partir de la corticale dans la région médiane, en vertu de la fluorescence pour toute modification de la répartition subcellulaire du marqueur organite.
4. Plantes positives sont transplantées dans le sol et leurs graines sont récoltées et projeté à nouveau pour confirmer le phénotype mutant dans la génération M3.
5. Retirez les au moins trois mutations de fond contaminantes par rétrocroisement fois à un génome de type sauvage peut containing le marqueur fluorescent organite désirée.
   1. De la plante mère, aide de ciseaux fins ou des pinces retirer siliques matures, et les fleurs ouvertes.
   2. Retirez les bourgeons qui sont trop petits à partir du méristème.
   3. Insérer la pointe d'une paire de pince entre pétales et sépales d'ouvrir un bourgeon de fleur et de supprimer toutes les anthères.
   4. En utilisant une paire de pince prendre une fleur ouverte maturité de la plante père et se frotter les anthères sur le stigmate de la plante émasculée.

3. Cartographie

Cette section décrit essentiellement comment mapper une mutation récessive utilisant un protocole modifié de Borevitz ⁹ qui est plus rapide si on le compare aux méthodes traditionnelles de cartographie ^10,11. Cette approche utiliser des tableaux d'oligonucléotides à haute densité avec la capacité de détecter de nombreux polymorphismes métrages simples (SFP) dans un seul essai ^12. Utilisation de l'Arabidopsis GeneChip tableau ATH1 est possible ded'analyser environ 24.000 gènes. Un pool d'individus F ₂ montrant la mutation est comparé à un bassin de type sauvage plantes F ₂ recueillies au sein de la même population en ségrégation. Ensuite, la mutation sera mappé dans la région où la piscine mutant est enrichi pour les allèles mutants génotype et par conséquent dans la même région de la piscine de type sauvage se traduira enrichi pour les allèles des parents de type sauvage ^13.

1. L'ADN génomique (3 ug) est extraite de la homozygote mutant Britannique (M3) en utilisant un Qiagen DNeasy Plant Mini Kit et est soumis à Illumina Genome Analyzer II (GA II) ¹⁴ séquençage.
2. Le mutant homozygote-Britannique (M3) est croisé avec Landsberg erecta pour générer une population de cartographie.
3. Le mappage est effectuée sur 70 jusqu'à 100 individus F2 présentant le phénotype aberrante et le même nombre de plantes F2 avec un phénotype de type sauvage.
4. Recueillir de chaque plante un disque feuilles (0,60 mm) en utilisant une perforatrice. Ladisque de feuille doivent être collectées à partir des feuilles du même âge pour être sûr d'avoir des quantités similaires de l'ADN. Les échantillons peuvent être traités pour l'extraction de génomique séparément ou en groupes. Dans ce cas, il est possible de prélever des échantillons 5-10 pour chaque tube Eppendorf de sorte que dans la fin, vous aurez moins de tubes eppendorf à partir de laquelle l'ADN génomique doit être extraite.
5. MasterPure usine de purification de l'ADN Feuille Kit (Epicentre) est utilisé pour extraire l'ADN génomique. L'ADN génomique obtenu à partir de chaque échantillon est quantifié avec un NanoDrop.
6. La même quantité d'ADN génomique à partir de chaque échantillon est ensuite mis en place pour un total de 300 ng (~ 30 pi) d'ADN de plantes; ajouter 60 ul 2.5X solution aléatoire amorces [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM de 2-mercaptoéthanol, 750 ug / ml amorces oligodé (octamères aléatoires)] (Bioprime kit) et 42 pi d'eau (volume final 132 pi).
7. ADN dénaturer à> 95 ° C pendant 5 à 10 min.
8. Laisser refroidir sur glace.
9. Pour chaque denatuADN rouge ajouter 15 pL mélange avec de la biotine 10X dNTP dCTP [1 mM biotine-14-dCTP, 1 mM de dCTP, 2 mM de dATP, 2 mM de dGTP, 2 mM de dTTP dans 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), et compléter avec 3 polymérase de Klenow ul (kit Bioprime).
10. Incuber une nuit à 25 ° C.
11. Le lendemain, ajouter 15 ul de NaOAc 3 M et 400 ul froide EtOH à 100%; mélange.
12. Incuber à -80 ° C pendant 1 heure, puis tourner à 20500 xg pendant 15 min, retirer le surnageant et laver avec 500 ul EtOH 75% froid.
13. Centrifuger à 20500 xg pendant 10 min.
14. Culots d'ADN sec à 37 ° C pendant 10 min et remettre en suspension dans 100 pi d'eau.
15. Utilisez 5 pi pour vérifier le rendement et la qualité sur un gel (Figure 2).
16. Envoyer 95 uL de l'étiquetage de réaction pour le type sauvage et mutant d'Arabidopsis pour GeneChip hybridation ATH1 tableau génome.
17. Les tableaux sont numérisées et les fichiers. CEL obtenus sont analysés en utilisant le logiciel R ( http://www.r-project.oRG /).
18. Installez le logiciel R, puis ouvrez le programme et coller la chaîne suivante:
    la source (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
    biocLite ()
    Ensuite, appuyez sur la touche retour-ce va installer les paquets standards (Bioconductor http://www.bioconductor.org ).
19. Dans un nouveau dossier sur votre bureau, télécharger à partir du site Web suivant ( http://www.naturalvariation.org/methods ) les fichiers:
    readcel.R
    SFP.R
    Map.R
    ath1V5.RData
    ColLerCEL.zip
    Le ColLerCEL.zip fichier doit être déballé et les fichiers résultants collé dans votre nouveau dossier.
20. Renommez les données obtenues à partir de votre expérience en GeneChip wildtype.CEL et mutant.CEL.
21. Copiez maintenant vos données GeneChip (wildtype.CEL etmutant.CEL) dans votre dossier.
22. Ouvert R, a) pour Mac: cliquez sur "Divers", puis cliquez sur "Changer le répertoire de travail." b) pour PC: cliquez sur "Fichier" puis "Changer le répertoire"
23. a) pour Mac: Sélectionnez le dossier contenant les fichiers. Cliquez sur "Espace de travail», «espace de travail du fichier Charger" et sélectionnez ath1V5.RData, b) pour PC: Sélectionnez le dossier contenant les fichiers ci-dessus, cliquez sur «Fichier», puis «espace de travail de charge" et sélectionnez ath1V5.RData.
24. ReadCEL.R Ouvrir avec Notepad et copier l'ensemble du texte à R.
25. SFP.R Ouvrir avec Notepad et copier l'ensemble du texte à R.
26. Map.R Ouvrir avec Notepad et copier l'ensemble du texte à R.
27. Dans la fenêtre de la console, vous verrez le message suivant:
    Chromosome X limite Mb yz
    Gènes de la recherche à TAIR coller dans ce lien
    3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& Fin = z
28. Copiez et collez le lien dans votre navigateur Internet. Une fenêtre apparaîtra et demander d'ouvrir ou enregistrer le fichier, vous devez sélectionner sauver. Choisir un nom de fichier et joindre l'extension ". Xls", puis cliquez sur Enregistrer.
29. Ouvrez le fichier ". Xls" où vous pouvez trouver les coordonnées de votre mutant (le résultat est représenté graphiquement dans la figure 3).
30. Dans la zone cartographiée dans le Illumina assemblé lit du génome mutant identifier des transitions EMS ⁴ parmi les polymorphismes de nucléotides simples. Compléter le phénotype mutant par transformation avec le gène de type sauvage (s) en utilisant des procédures standard ^15.

4. Les résultats représentatifs

La figure 1 montre l'approche utilisée pour l'identification d'un mutant de la voie de sécrétion en utilisant la microscopie confocale de dépistage. La figure 2 montre une préparation typique de l'ADN génomique marqué pour l'hybridation tableau. Dans la figure 3, un résultat typique attendue après l'analyse des données obtenues à partir de la baie de GeneChip Arabidopsis Genome ATH1 est présenté.

Figure 1. Arabidopsis plantes transgéniques exprimant ssGFPHDEL (ER marqueur) (1) ont été cultivées pour produire assez de semences pour l'EMS de traitement (2). Les semences traitées avec EMS ont été ensuite semées pour générer des plantes M1 (3). Chaque plante M1 représente une ligne différente et des semences ont été recueillies séparément de chacun d'eux. Graines M2 ont été étalées sur ½ MS substrat (4), puis criblée de défauts dans la morphologie ER par microscopie confocale (5). Pendant la projection, nous avons trouvé des plantes qui a conservé la morphologie de type sauvage ER (6) et les plantes qui montrent défectueux phénotypes ER (7). Ces plantes ont été cultivées pour obtenir la génération M3 et de confirmer le phénotype (8). L'ADN génomique de la plante M3 a été utilisé pour le séquençage Illumina Solexa (a). La même plantea également été utilisée pour des croisements avec Ler-poids pour obtenir la population de cartographie F2 (b).

Figure 2. Bioprime réactions de marquage aléatoire (5 pi de 100 ul) ont été chargés sur un gel d'agarose 1%. Lane a est à partir d'un pool de plantes de type sauvage F2, et la voie b est à partir d'un pool de mutants plantes F2. (Marker est de 1 Kb d'ADN en échelle N3232, à partir de l'ONÉ).

Figure 3. La figure représente un exemple de la cartographie du Col-0 mutation en utilisant Arabidopsis GeneChip ATH1 hybridation génomique Array. La mutation dans cet exemple est situé sur le chromosome 1 délimité, par des barres verticales. Les barres horizontales représentent les seuils de détection.

Discussion

Ici, nous décrit une microscopie confocale d'un dépistage pour l'identification des mutants endomembranaire. Cette approche peut être facilement étendu pour d'autres organites de la cellule pour laquelle des marqueurs spécifiques de protéines fluorescentes sont disponibles. L'écran est basée sur l'identification de mutants qui montrent une répartition aberrante du marqueur fluorescent, soit dans l'organite cible ou à organites qui ne sont pas censé contenir le marqueur. Respectivement,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Sulfonate éthylméthane	Sigma	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Murashige Skoog basales moyennes w Gamborg vitamines	Phyto technolog Laboratorie	M404
Phytagel	Sigma	P8169-1 kg
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Maître pur de feuille d'usine de purification de l'ADN kit	Epicentre	MPP92100
Bioprime système d'étiquetage d'ADN	Invitrogen	18094-011
Alcool 200 Proof	Decan laboratoires inc.	2716
NaOAc	JT Baker
ATH1 Arabidopsis Gene pucetableau génome	Affymetrix	900385
Tubes Falcon 50 ml	Corning	430290
Tubes Eppendorf de 1,5 ml
Le papier-filtre 90mm	Whatman	1001090
Balance analytique	Mettler Toledo AB54-S	na
Nutation (vague) agitateur	Heidolph POLYMAX 1040	na
Centrifuger	Eppendorf 5417-R	na