Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

Résumé

Une procédure de dépistage en temps réel pour identifier les médicaments qui interagissent avec la protéine G-dépendants vers l'intérieur K redresseur ⁺ (Girk) canaux est décrite. Le test utilise le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles pour mesurer l'activité du canal Girk. Cette méthode est adaptable pour une utilisation sur un certain nombre de lignes de cellules.

Résumé

Aux protéines G-dépendants vers l'intérieur de redresseur ^K + (Girk) canaux fonctionnent en tant que médiateurs cellulaires d'un large éventail d'hormones et de neurotransmetteurs et sont exprimés dans le cerveau, le cœur, le muscle squelettique et le tissu endocrinien ^1,2. Canaux Girk sont activés suite à la liaison des ligands (neurotransmetteurs, des hormones, médicaments, etc) pour leur plasma liée à la membrane, couplés aux protéines G (RCPG récepteurs). Cette fixation provoque la stimulation de protéines G (G _i et G _o) qui se lient à la suite et d'activer le canal de Girk. Une fois ouvert le canal Girk permet le mouvement de K ⁺ hors de la cellule provoquant la membrane de repos potentiel pour devenir plus négative. En conséquence, l'activation du canal dans les neurones diminue Girk spontanée formation potentielle d'action et inhibe la libération de neurotransmetteurs excitateurs. Dans le cœur, l'activation du canal Girk inhibe l'activité pacemaker ce qui ralentit le rythme cardiaque. 3. Toutefois, la pharmacologie de ces canaux reste largement inexploré. Bien qu'un certain nombre de médicaments, y compris les agents anti-arythmiques, les médicaments antipsychotiques et les antidépresseurs bloquent le canal Girk, cette inhibition n'est pas sélective et se produit à des concentrations relativement élevées de médicaments ^3.

Ici, nous décrivons un test de dépistage en temps réel pour identifier les nouveaux modulateurs de canaux Girk. Dans cet essai, neuronales AtT20 cellules, exprimant les canaux Girk, sont chargés de potentiel de membrane colorants fluorescents sensibles tels que le bis-(1,3-dibutylbarbituric acide) triméthine oxonol [DiBAC ₄ (3)] ou HLB 021-152 (Figure 1 ). Les molécules de colorant devient fortement fluorescent absorption suivant dans les cellules (Figure 1). Traitementdes cellules avec des ligands GPCR stimule les canaux Girk à ouvrir. Le résultant efflux de K ⁺ hors de la cellule provoque le potentiel de membrane à devenir négative et le signal fluorescent de diminuer (figure 1). Ainsi, les médicaments qui modulent efflux de K ⁺ à travers le canal Girk peut être dosé en utilisant un lecteur de plaque fluorescente. Contrairement à d'autres tests de dépistage d'ions de canal, comme la spectrométrie d'absorption atomique ⁴ ou radiotraceur analyse ^5, le test de canal Girk fluorescente fournit une procédure de dépistage rapide, en temps réel et peu coûteux.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Cultiver l'hypophyse AtT20 cellules dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de cheval 10% et de maintenir les cultures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2.
2. Maintenir la culture par repiquage des cellules toutes les 5 à 7 jours en utilisant une procédure standard de traitement à la trypsine.
3. Enrober les puits de noir, fond transparent, des plaques à 96 puits avec 50 pl de poly-L-lysine. Laisser sécher les puits pendant 30 min dans l'incubateur.
4. Plaque des cellules dans les plaques à 96 puits contenant 200 ul médias à une densité de 30.000 cellules par puits et de stocker les cellules dans l'incubateur pendant 3-4 jours.
5. Utilisation d'une installation d'aspiration, un bouchon constitué d'un pot de 4 litres connecté à un vide à une extrémité et une pointe de pipette 200 pi à l'autre extrémité, à lentement aspirer le milieu de culture la monocouche de cellules d'.
6. Laver les cellules avec 200 ul de solution tampon normale (132 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM CaCl _2, MgCl ₂ 1 mM, 5 mM de dextrose, 5 mM d'HEPES, pH 7,4 avec NaOH).
7. Ajouter 200 ul de solution tampon contenant du potentiel de membrane colorant sensible (MPD) DiBAC ₄ (3) ou HLB 021-152 (5 uM) à chaque puits et incuber les cellules pendant 40 min à 37 ° C.

2. Préparation des composés d'essai et de traitement cellulaire

1. Préparer une dilution en série de composés d'essai (stock = 10 mM dans le DMSO) à partir d'une bibliothèque de composés (en format 96 puits) en utilisant un Versette (ThermoFisher) système automatisé de traitement des liquides.
2. Retirer la plaque de 96 puits, contenant les cellules AtT20, de l'incubateur et permettre à la plaque pour revenir à la température ambiante. Aspirer le tampon vieille et appliquer la solution tampon frais contenant de la DPV pour les cellules.
3. En utilisant le système de traitement des liquides s'appliquent différentes concentrations (10 nm à 10 um) des composés d'essai (2 à 20 pi) et des solutions de contrôle (0,1% de DMSO) (en solution tampon containing le MPD) à la plaque de 96 puits contenant les cellules.
4. Incuber les cellules pendant 5 min avec des composés d'essai avant les mesures fluorescentes.

3. Activation des canaux Girk, la mesure de fluorescence et de l'analyse

1. Insérez la plaque de 96 puits dans un lecteur de Biotek Synergy2 plaque fluorescente et d'obtenir le signal de fond de fluorescence à des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 520 et 560 nm, respectivement.
2. Appliquer les ligands GPCR (somatostatine = 200 nM ou carbachol = 10 pM) ou la solution de contrôle (tampon seul) (20 pi) dans les puits (volume total = 220 pi) pour activer les canaux Girk utilisant le système Synergy2 injecteur. Recueillir des points de données à intervalles de 10 s pendant une période d'échantillonnage 300 s à longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 520 et 560 nm, respectivement.
3. Obtenir le cours du temps et de l'amplitude de crête du changement fluorescent à l'aide Biotek Gen5 logiciels et exporter les données vers Excel pour une analyse plus approfondie.
4. Calculer la Z'-facteur pour déterminer la fiabilité du dosage. Plaques utilisées pour Z'-facteur de détermination de contenu 2 rangées chacune de positif (ligand GPCR) et négatif (tampon seul) des contrôles. Le Z'-facteur est défini comme: Z '= 1 - (3σ _P + _N 3σ) / | _P μ - μ _N |, où μ _P et _N μ sont les moyens de contrôle positif et négatif des signaux de commande, et sigma _P & _N sigma sont les écarts-types du contrôle positif et négatif des signaux de commande, respectivement ^6. Z'-facteurs dans la gamme de 0,5 à 1,0 indiquent que la qualité de l'essai est excellente ^6. Plaques avec Z'-facteurs inférieurs à 0,5 sont exclues de l'analyse.
5. Les composés qui modulent le signal de fluorescence sont retestés par la présence de Ba ^{2 +} ou tertiapin-Q pour confirmer l'intérieur redresseur K ⁺ spécificité canal.

4. RRésultats eprésentant

Un exemple du signal de fluorescence mesuré à l'aide du test de canal Girk est montré dans la figure 2. Addition de la somatostatine ligand GPCR (200 nM) aux cellules provoquée AtT20 une rapide, dépendant du temps diminution de la valeur HLB 021-152 signal fluorescent (figure 2). Par contre, addition d'une solution de commande produit une petite élévation instantanée de la fluorescence en fonction du temps que retourné à la ligne de base (figure 2). Comparaison des valeurs de crête de fluorescence dans plaques à 96 puits injectés avec des solutions de commande et la somatostatine a un Z'-facteurs dans la gamme de 0,5 à 0,7. Pour la quantification en outre, l'enregistrement de contrôle a été soustraite du dossier de la somatostatine et le résultant somatostatine-sensibles signal analysé (figure 2).

Le test fournit une méthode pour identifier rapidement les médicaments qui modulent les canaux Girk. Par exemple, les médicaments qui inhibent la cha Girknnel doit réduire GPCR ligand à médiation diminue de fluorescence en empêchant efflux de K ⁺ à partir des cellules. Comme le montre la figure 3, le traitement des cellules avec tertiapin-Q, une toxine qui bloque canaux Girk ^7, produit une inhibition de la somatostatine à médiation changement fluorescente. Propafénone, un médicament anti-arythmique qui bloque les canaux Girk dans le cœur ^8, ont aussi inhibé le changement fluorescente (Figure 4). Le test pourrait également être utile pour identifier des activateurs de la voie Girk. Toutefois, l'application de l'éthanol (100 & 200 mM), un activateur de la voie Girk ^2,3, n'a pas causé de changement significatif dans le signal de fluorescence par rapport à la solution de contrôle (p> 0,5).

Figure 1. La conception expérimentale de l'essai de canal Girk fluorescente. AtT20 cellules sont incubées dans un tampon contenant une membrane potentiel sensible à colorant fluorescent (D). Les molécules de colorant entrer dans les cellules et deviennent fluorescentes lors de la liaison aux protéines intracellulaires (panneau supérieur). Liaison de la somatostatine (Som) à son GPCR stimule la protéine inhibitrice G (G _i) provoquant l'activation du canal Girk (panneau inférieur). L'efflux subséquente de K ⁺ à partir des cellules provoque la membrane potentiel à devenir négative et les molécules de colorant pour sortir les cellules. En conséquence, les baisses signal fluorescent (panneau inférieur).

Figure 2. Représentative HLB 021-152 signal de fluorescence mesurée avec le temps dans les cellules AtT20 pendant l'addition de la somatostatine ou d'une solution de contrôle. Le rapport de l'intensité de fluorescence (F / F _O) a été calculée en divisant le signal de présence (F) de la somatostatine (ou une solution de commande) par le signal de référence mesuré avant (F _O) adcondition de la somatostatine (ou une solution de contrôle). Chaque point représente la moyenne ± SE obtenu en 5-6 puits. La somatostatine ou d'une solution de contrôle a été ajouté au temps zéro (↓). Ajout de la solution de contrôle a entraîné une légère augmentation transitoire du signal fluorescent. Cette suite à un changement de température provoquée par l'injection de la solution.

Figure 3. Traitement des cellules avec AtT20 tertiapin-Q (500 nM) inhibe la diminution somatostatine à médiation dans le signal fluorescent en se liant à et en bloquant les canaux Girk. Chaque point représente la moyenne ± SE obtenu en 4-6 puits. La somatostatine a été ajouté au temps zéro (↓).

Figure 4. Traitement des cellules avec AtT20 propafénone (20 uM) inhibe également la diminution de la somatostatine à médiation dansle signal fluorescent. Chaque point représente la moyenne ± SE obtenu en 5-6 puits. La somatostatine a été ajouté au temps zéro (↓).

Discussion

Bien que le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles ont été utilisés pour identifier les médicaments qui modulent les canaux ioniques ^9,10, c'est le premier rapport de leur demande de neurones Girk drogues Discovery Channel. Le test de canal Girk fluorescente présentée ici fournit une méthode rapide, fiable et en temps réel pour le criblage de ligand-dépendants canaux ^K +. Le dosage peut être modifié pour une utilisation avec une large gamme de cellules, y compris des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
DMEM	Cellgro	10-013
Sérum de cheval	Invitrogen	16050-114
Plaques à 96 puits	Corning	3603
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
La somatostatine	Sigma-Aldrich	S9129
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Gestionnaire Versette liquide automatisé	ThermoFisher	650-01
Synergy2 lecteur de plaque fluorescente	Biotek
Gen5 analyse sLOGICIEL	Biotek