Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

Résumé

C'est une méthode rapide et complète de l'immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l'enrichissement de Gr-1 ⁺ Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1 ⁺ Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation In vivo Et In vitro Tests.

Résumé

MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s'accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l'inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l'hôte, le diabète et le cancer ^1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface ^7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d'une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs ^7-10. Toutefois, en fonction de l'état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression ^11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l'élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo.

Récemment, le Ghansah groupe a signalé l'expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l'homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC ^13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s'agit d'une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l'enrichissement de ^Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l'enrichissement de la ^Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante ^Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l'inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l'aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 ^{+ de} leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l'augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 ^{+ de} leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro

Protocole

Avant de commencer, préparer les solutions suivantes:

3% de coloration des médias (SM):

-3% De sérum bovin foetal (FBS) dans 1X tampon phosphate salin (PBS)

MACS tampon (Mo):

- 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 1XPBS

1. Les rates de récolte provenant de souris

1. Voie sous-cutanée d'injecter 6-8 semaines d'âge C57BL / 6 souris (Harlan) avec 1,5 x 10 ⁵ murins Panc02 cellules en suspension dans 100 ul de PBS 1x (porteur de tumeurs; TB). Les souris témoins (Naïve) de recevoir 100 1XPBS ul.
2. Environ quatre semaines après l'injection, les souris euthanasier par asphyxie de dioxyde de carbone.
3. Rates de récolte de la souris par dissection aide de pinces et ciseaux, puis peser à l'aide d'un équilibre. Placer les rates séparé, étiqueté tubes de 50 ml coniques contenant 1 x PBS.

2. Générer un Fourches unicellulairen des leucocytes de la rate

Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique et les cellules et d'anticorps conservés sur la glace.

1. Assembler le tamis de dissociation cellulaire par l'insertion du tamis à mailles dans l'ouverture de la coupelle vers le bas. Ensuite, insérez la bague de retenue dans la zone filetée avec le côté rainuré et d'utiliser le porte-clés pour serrer la bague de retenue, tenant ainsi à l'écran en place. Placez le tamis monté dans une boîte de Pétri contenant 10 ml 1 x PBS.
2. Rates Piscine et pilon en verre utilisation pour moudre la rate contre le grillage de la cellule de dissociation tamis et dans la boîte de Pétri. Répétez l'opération pour chaque groupe de traitement de la souris.
3. Suspension cellulaire filtre dans un tube de 50 ml conique à l'aide d'une passoire 70 um cellulaire et d'une pipette de 5 ml sérologique. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
4. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml 1 x tampon de lyse RBC par la rate. Pipet et vigoureusement vers le bas. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Arrêter la réaction en ajoutant 20 ml de 1 x PBS. Pipet et vigoureusement vers le bas. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
5. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 ml de PBS stérile 1 x. Pipet et vigoureusement vers le bas.
6. Compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémacytomètre et resuspendre à la concentration désirée en SM 3% de telle sorte que 50 pl est équivalente à 5x10 ^{5-1x10 6} cellules (1x10 ⁷ cellules / ml - 2x10 ⁷ cellules / ml).

3. Cell-surface de coloration / immunophénotypage des MDSC par cytométrie en flux

1. Étiquetez les puits d'une plaque de 96 puits fond en V pour le contrôle et les échantillons expérimentaux et des taches simples pour les contrôles de rémunération (n ° Teinté, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC et DAPI).
2. Ajouter 5x10 ^{5-1x10 6} cellules équivalentes à 50 pl / puits de splénocytes à leurs puits respectifs dans le 96-V-même la plaque inférieure. Centrifugerplaque à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min.
3. Préparer "Mix Master" (MM) de la souris BD Bloquer Fc (rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal) dilué dans SM 3%, dans un microtube de 1,5 ml sur la glace. Comme point de départ, utilisez 1 ug Fc Bloquer dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits.
4. Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure en mettant rapidement inverser la plaque sur et à l'arrière, sur un conteneur à déchets ou dans l'évier sans interruption des culots cellulaires.
5. Vortex, centrifuger brièvement MM Bloquer Fc pendant 5 secondes et ajouter 50 ul à tous les granulés dans le 96-V-même la plaque inférieure. Bien mélanger en douceur pipetant, laissant des échantillons dans leurs puits. Incuber la plaque pendant 15 min dans l'obscurité sur la glace. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
6. Préparer "Mix Master" (MM) de fluorochrome-anticorps conjugués dilués dans SM 3% dans un microtube de 1,5 ml sur la glace, tandis que les échantillons incuber avec le bloc Fc. Anticorps doit être adaptéepour déterminer les dilutions optimales pour les procédures de coloration. Comme point de départ, combiner une dilution 1:25 de Mac-1-FITC et dilution 1:20 de Gr-1-APC dans SM 3% pour un volume final de 50 ul, par échantillon.
7. Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment.
8. Vortex, centrifuger brièvement MM d'anticorps conjugués coloration fluorescente pendant 5 secondes et ajouter 50 ul de contrôle et de pastilles expérimentales. Bien mélanger en douceur pipetant. Pour une seule tache compensations, ajoutez une dilution 1:25 de Mac-1-FITC, dilution 1:20 de Gr-1-APC et 75 ng / ml de DAPI, dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits à leurs puits respectifs. Ajouter 50 ul SM 3% à souillé bien (aucune tache). Bien mélanger et incuber les cellules dans 96 puits à fond en V plaque pendant 30 min dans l'obscurité sur la glace.
9. FACS étiquettes des tubes (5 ml, 12 mm x 75 mm tubes en polystyrène fond rond) pour correspondre à chaque puits de la plaque de 96 puits à fond en V. Ajouter 200 ul SM 3% à chaque FACSTube.
10. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min et retirez surnageants. Laver granulés par addition de 100 ul SM 3% à chaque pastille et bien mélanger délicatement par aspiration et refoulement. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. Répétez l'étape laver une fois de plus.
11. Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment. Remettre en suspension chaque culot dans 100 SM 3% ul et bien mélanger.
12. Transférer 100 ul culot remis en suspension à partir de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure à leur tube FACS respectivement étiquetés.
13. Avant l'analyse des flux cytométrie, ajouter 75 ng / ml de DAPI à contrôler et échantillons expérimentaux et de contrôle unique de compensation DAPI tache.
14. Effectuer flux d'acquisition de données par cytométrie de pourcentages MDSC. Effectuer une compensation utilisant le négatif (pas de contrôle tache) et les contrôles simples positifs. Mettre en place un dot plot qui affiche la diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à côté (SSC) en échelle logarithmique afin que les populations de leucocytes deintérêt peut être identifié. Dessiner une grande porte sur tous les leucocytes, à l'exclusion des débris et des bouquets avec le plus bas vers l'avant et la diffusion latérale. De cette porte parent, créez un tracé nouveau point qui affiche SSC par rapport DAPI et porte sur DAPI-(live) des cellules. Sélectionnez cette population nouvellement fermé et créer un nuage de points qui affiche Mac-1 par rapport Gr-1 et la porte sur votre positif double (Mac-1 ⁺ Gr-1 ⁺⁾ MDSC.

4. Enrichissement magnétique de GR-1 ^{+ de} leucocytes

1. Aliquotes 1x10 ⁷ autres leucocytes non colorés dans des tubes FACS étiquetés de façon appropriée et centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
2. Préparer MM de Gr-1-PE anticorps dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 ⁷ cellules, utilisez une dilution 1:10 de Gr-1-PE anticorps dans 50 Mo ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l'échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité.
3. Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant.
4. Préparer MM de l'Anti-PE microbilles dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 ⁷ cellules, utiliser une dilution 1:04 de l'anti-PE microbilles dans 200 MB ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l'échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité.
5. Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 ml de SB. Filtrez dans une passoire 70 um dans une nouvelle, marquée tube de 50 ml conique.
6. Préparer et le Premier MACS Auto Pro Separator. Recharge toutes les bouteilles avec les solutions appropriées et de vider la bouteille de déchets, si nécessaire. Activer instrument sur et examiner l'état de récipients de fluide et de colonne (s) après l'initialisation. Tous les symboles doivent être de couleur verte. Dans le menu, sélectionnez "Séparation" de la partie supérieurebarre de menu puis "Lavez maintenant" de la barre de menu inférieure. Sélectionnez "Rinçage" de l'option pop-up suivi de "Run" pour démarrer le processus d'amorçage. Une fois le processus d'amorçage est terminé avec succès, l'instrument affichera alors qu'il est "prêt pour la séparation" dans le menu Status.
7. Choisissez convient portoir réfrigéré pour les tailles de tubes et les placer tube de 50 ml conique avec des cellules marquées magnétiquement dans la ligne A, 50 ml tube conique pour la collecte de la fraction négative à la ligne B et 15 ml tube conique pour la collecte de fraction positive dans la ligne C.
8. Choisissez "POSSEL_S" programme de séparation des cellules pour la sélection positive des cellules cibles marquées en mode sensible à partir d'échantillons. Cellules cibles marquées magnétiquement sont retenus sur la colonne automates; cellules non marquées sont libérés dans le tube de prélèvement fraction négative dans B. Sur la ligne de rétraction automatique de l'aimant, les cellules cibles marquées seront libérés dans le tube de prélèvement positif à la ligne C du tube crémaillère.

5. Post-Trier analyse de GR-1 ^{+ de} leucocytes enrichies

1. Recount Gr-1 ⁺ et Gr-1 ^- fractions en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre. Resuspendre les cellules à concentration souhaitée dans le milieu de coloration 3% alors que 50 ul est équivalent à 5x10 ^{5-1x10 6} cellules (1x10 ⁷ cellules / ml - 2x10 ⁷ cellules / ml) et le transfert de 50 pi à conséquence étiquetés tubes FACS.
2. Préparer un MM de Mac-1 seulement, à une dilution 1:25 dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par échantillon. Colorer les cellules et de préparer simples compensations taches de Gr-PE, Mac-1 FITC et DAPI pour l'analyse par cytométrie en flux. Ajouter 200 pi 3% SM et le colorant DAPI viabilité comme décrit précédemment.
3. Effectuer flux d'acquisition par cytométrie de données pour déterminer Gr-1 ⁺ et Gr-1 ^- pourcentages et aussi comparer les pourcentages MDSC enrichissement pré-et post-autoMACS.

6. Les résultats représentatifs

Ici, nous montrons r résultats eprésentant pour l'enrichissement autoMACS de ^Gr-1 + leucocytes à partir du mélange, la rate naïfs pour FACS ultérieures de tri du MDSC (Figure 1). 1x10 ⁶ leucocytes naïfs ont été colorées avec Mac-1-FITC et Gr-1-APC anticorps pour identifier les pourcentages MDSC en utilisant un instrument BD LSRII, avant tri autoMACS. 1x10 ⁷ leucocytes naïfs ont ensuite été colorées avec des anticorps anti-Gr-1-PE anticorps et PE-Microbilles pour l'enrichissement de la ^Gr-1 + leucocytes en utilisant un séparateur autoMACS Pro. Post-autoMACS enrichissement, GR-1 pourcentages en Gr-1 ⁺ et Gr-1 ^- fractions recueillies ont été évaluées en utilisant la cytométrie de flux. 1x10 ⁶ Gr-1 ^{+ de} leucocytes ont été enlevés et colorées avec Mac-1-FITC anticorps à analyser et à comparer les pourcentages de MDSC enrichi, mis en commun des leucocytes naïfs à la non-enrichi, mis en commun porteuses de tumeurs leucocytes par cytométrie de flux.

fig1.jpg "/>
Figure 1. L'enrichissement autoMACS de Naïve ^Gr-1 + leucocytes pour FACS MDSC de tri. Les rates ont été récoltées à partir de souris porteuses de tumeurs pancréatiques et naïf et transformé en mono-cellulaires suspensions. Cytométrie en flux de surface de leucocytes colorés avec naïfs Mac-1 et Gr-1 fluorescente-conjugués d'anticorps, avant l'enrichissement autoMACS (A). L'analyse par cytométrie en flux de Gr-1 ⁺ (B) et Gr-1 ^- (C) des fractions post-autoMACS enrichissement de ^Gr-1 + cellules de mise en commun leuckocytes naïfs colorées avec Gr-1-PE et des anticorps anti-PE microbilles. L'analyse par cytométrie en flux du MDSC et Gr-1 ⁺ pourcentages post-autoMACS enrichissement de Gr-1 ^{+ de} cellules de mise en commun des leucocytes naïfs (D) par rapport aux non-enrichis leucocytes communs de souris porteuses de tumeurs (E) (souris naïves, n = 5 ; souris porteuses de tumeurs, n = 3). MDSC et GR-1 pourcentages sont déclenchés dans les tracés de contours représentatives et des histogrammes.

Discussion

Il s'agit d'une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l'enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l'isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes ^4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques ^5, isolement de la moelle osseuse neu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REACTIF	SOCIÉTÉ	Catalogue	COMMENTAIRES
Phosphate Buffered Saline 1X	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca 2 + / Mg 2 + / rouge de phénol libre
L'albumine de sérum bovin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Laissez dissoudre BSA intacte dans du PBS; Environnement stérile
Sérum de veau fœtal (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Inactivé par la chaleur; Environnement stérile
Rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal (Fc Bloquer)	BD Biosciences	553142	Environnement stérile
Anti-souris CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	StérileEnvironnement
Anti-souris Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Environnement stérile
Anti-souris Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Environnement stérile
DAPI	Invitrogen	D1306	Environnement dilution en série stérile
Dissociation cellulaire Sieve	Sigma-Aldrich	CD1-1kt	Autoclave avant utilisation
70-um crépine	BD Biosciences	352350	Environnement stérile
Tampon de lyse 1X RBC	eBiosciences	00-4333-57	Chaud à la température ambiante avant utilisation; Environnement stérile
Des boîtes de Pétri	Fisher Scientific	08-757-12	Environnement stérile
50ml contubes iCal	Thermo Scientific	339652	Environnement stérile
5ml 12X75mm tubes en polystyrène fond rond	BD Biosciences	352054	Connu sous le nom tubes FACS; Environnement stérile
96 puits à fond en V plaques	Corning	3897	Environnement stérile
Bleu de Trypan	Cellgro	25-900-CI	Environnement stérile
PE Microbilles	Miltenyi Biotec	130-048-801	Environnement stérile
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Colonnes autoMACS	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS course tampon	Miltenyi Biotec	130-091-221