Tests cliniques et retrait de la moelle épinière dans un modèle de souris pour la sclérose latérale amyotrophique (SLA)

Résumé

Un modèle de souris pour la sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un examen clinique et comportemental. Comme condition préalable à une analyse qui l'accompagne immunohistologique la préparation de la moelle épinière est représentée en détail.

Résumé

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurodégénérative mortelle entraînant une dégénérescence progressive des motoneurones. Pic d'apparition est d'environ 60 ans pour la maladie sporadique et autour de 50 ans pour la maladie familiale. En raison de sa marche progressive, 50% des patients meurent dans les 30 mois à compter de l'apparition des symptômes. Afin d'évaluer les options thérapeutiques pour cette maladie, les modèles génétiques de souris de la SLA ont été générés sur la base de l'homme mutations familiales dans le gène SOD, tels que la SOD1 (G93A) mutation. Les aspects les plus importants qui doivent être évaluées dans le modèle sont la survie globale, l'évolution clinique et la fonction motrice. Ici, nous démontrons l'évaluation clinique, montrent la conduction de deux essais de moteurs comportementaux et fournir des systèmes de notation pour tous les paramètres quantitatifs. Parce que une analyse en profondeur du modèle de souris SLA nécessite habituellement un examen immunohistochimique de la moelle épinière, nous démontrons sa préparation en détail l'application de la faireméthode laminectomie rselle. Des exemples de résultats histologiques sont mises en évidence. L'application complète des méthodes d'examen décrits dans les études sur le modèle murin de la SLA permettra au chercheur de tester de manière fiable les futures options thérapeutiques qui peuvent fournir une base pour plus tard les essais cliniques humains.

Protocole

Les animaux ont été achetés auprès de Jackson Laboratory (# 002726) ^1. Ils sont cliniquement marqué et soumis à un test de la fonction motrice (rotarod test) et de la force musculaire (test du fil suspendu). Tous ces tests et la mise à mort plus tard des animaux en vue de préparer la moelle épinière ont été effectuées conformément à proximité immédiate des lignes directrices locales pour le bon déroulement de l'expérimentation animale.

1. Score clinique

Outre l'évaluation pour les souris de poids corporel sont les signes de déficit moteur avec les 4 suivants système de notation, point ^2:

4 points: normal (aucun signe de dysfonctionnement moteur)

3 points: tremblements des membres postérieurs sont évidents quand il est suspendu par la queue

2 points: anomalies de la démarche sont présents

1 point: en faisant glisser d'au moins un membre postérieur

0 point: symétriquela paralysie, l'incapacité de droit lui-même ou la perte de 20% du poids maximal du corps, dans ce cas, les animaux sont euthanasiés immédiatement, et l'expérience est terminée

2. Tests de la fonction motrice et la force musculaire

Suspendu en fil métallique

Ce test est utilisé pour évaluer la force musculaire ^{3, 4.} Tous les animaux d'effectuer ce test au moins un ou deux jours après le test rotarod. Chaque souris est placé sur un couvercle métallique sur mesure avec des intervalles de 0,8 cm et avec précaution à l'envers, 60 cm au-dessus d'une paille recouverte de fond. Après une formation de trois fois consécutives d'au moins 180 s le temps de latence de tomber est mesurée. Chaque souris est livrée à trois tentatives de tenir sur le couvercle inversé pour un maximum de 180 s et la plus longue période sont enregistrés.

Rotarod test

Le dispositif rotarod (Ugo Basile, Comerio, Italie) a été utilisé pour mesurer la coordination motrice, l'équilibre et la capacité d'apprentissage du moteur ^{3, 4.} Une bonne performance exige un degré élevé de coordination sensori-motrice. La machine doit être placé dans un environnement calme et non-inquiétant pour éviter les stimuli distractive pour l'animal testé. Il se compose d'un ordinateur contrôlé par broche entraînée par moteur rotatif et cinq voies pour cinq souris. Chutes des souris sont détectés automatiquement par pression sur une plaque en matière plastique au fond. Après une formation de trois fois consécutives d'au moins 180 s à une vitesse constante de 15 rpm, le temps pour lequel un animal peut rester sur la tige de rotation est mesurée. Chaque animal subit trois essais et la plus longue latence sans tomber est enregistrée. Le temps de 180 s est choisi comme seuil de temps parce que la majorité des différences significatives dans la coordination motrice sont détectés dans ce laps de temps.

3. Préparation de la moelle épinière

1. Les animaux sont tués par l'insufflation de CO ₂ en conformité avec les directives locales et sont immédiatement perfusé avec une solution PBS transcardiaque suivie par une solution de paraformaldéhyde à 4%.
2. Afin de préparer la moelle épinière de la souris sacrifiée, l'animal est placé sur une table d'opération et les quatre branches sont fixées sur le côté de manière à exposer la face arrière de la souris.
3. Un lavage court avec une solution d'éthanol à 70% nettoie le site de la dissection et aplatit le poil.
4. Ensuite, la peau est incisée avec un scalpel dans la ligne médiane. Afin de faciliter la coupe de la peau est tendue des deux côtés. Si les muscles des jambes doivent être préparés, leur peau doit également être incisés.
5. Après l'incision de la peau est terminée, il est tiré sur le côté avec une paire de pincettes pour exposer le fascia sous-jacent superficielle du corps.
6. La musculature de la nuque et le ligament nucal doivent être enlevés et sont carefully préparée. Veillez à ne pas inciser profondément et à une lésion de la moelle épinière. Les muscles de l'épaule peut également être retiré afin de mieux exposer la colonne vertébrale.
7. Puis les muscles paravertébraux sont retirés de la colonne vertébrale ensemble.
8. Afin d'ouvrir les laminectomies la colonne vertébrale plusieurs doivent être effectuées. On devrait commencer à partir de la partie supérieure du crâne sur le site de l'articulation atlanto-occipitale.
9. Il est plus facile d'enlever la fixation des deux membres supérieurs et du cou étirer à être mieux en mesure d'effectuer la laminectomie de la première vertèbre. Ceux-ci sont arraché sans toucher à la moelle épinière cervicale exposée.
10. Plus les vertèbres sont enlevés d'abord sectionnant les arcs vertébraux des deux côtés avec des ciseaux à angle, puis en tirant sur les apophyses dorsales. Les autres parties latérales des vertèbres doivent être enlevées pour faciliter le retrait ultérieur complète de la moelle épinière.
11. Un repère anatomique de la spina lombairecordon l est l'intumescence qui est également présent dans la moelle épinière cervicale.
12. Après avoir terminé la laminectomie de la moelle épinière entière, assurez-vous que vous avez également transect tous les racines ventrales et de libérer la moelle épinière de la dure-mère des méninges.
13. Ensuite, la moelle épinière cervicale est coupée en haut et en vous commencez à retirer la moelle épinière.
14. Enfin la moelle épinière est également coupé à la queue-queue distale d'être complètement libéré.
15. En fin de compte, la moelle épinière est placé dans une solution postfixating (paraformaldéhyde 4% par exemple) pendant la nuit et peuvent être traitées ultérieurement. Nous avons l'habitude Coupe à congélation de la moelle épinière pour le préparer pour l'analyse immunohistochimique.

4. Les résultats représentatifs

La technique de préparation représente la moelle épinière au centre de cet article vidéo. Il est une condition essentielle pour la coupe des tissus plus tard et, finalement, pour l'analyse immunohistochimique de spinacoupes de la moelle l. A titre d'exemple d'un résultat final, un bilan immunohistochimique de la région de la corne antérieure de la souris la moelle épinière lombaire d'un type sauvage (wt) et d'une SOD G93A transgène (tg) de la souris est démontrée. Les neurones moteurs peuvent être identifiés avec un primaire anti-ChAT anticorps et après marquage fluorescent avec un secondaire Cy3 anticorps. En outre, une centrale nucléaire contre-tache avec du DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) a été réalisée (Figure 1).

Figure 1. Photomicrographies fluorescentes visualiser l'immunodétection des motoneurones avec des anti-ChAT anticorps (rouge) et les noyaux cellulaires contre-tache par DAPI (en bleu) chez la souris cordon corne lombaire antérieure d'un type sauvage (wt) (à gauche) et de une SOD G93A transgénique (tg) (à droite) de la souris à l'âge de 130 jours. La barre d'échelle: 40 um.

Comme l'analyse immunohistochimique deles souris G93A SOD n'est pas le champ d'application principal de cet article s'il vous plaît consulter la publication originale dans laquelle ces souris transgéniques ont été caractérisés et d'autres plus récents qui étudient des approches thérapeutiques pour davantage de référence ^{1, 5, 6.} Si les effets thérapeutiques doivent être différenciées sur le plan immunohistochimique clairement défini des algorithmes d'évaluation quantitatives devraient être appliquées, financées par un logiciel stéréologique (voir par exemple ^7).

Discussion

La SOD1 (G93A) modèle de souris génétique est un modèle animal utile pour étudier la progression de la maladie de la perte progressive des neurones moteurs comparable à l'homme la sclérose latérale amyotrophique ^8. Une variété de paradigmes différents traitements ont été évalués dans ce modèle et représentent une base pour plus tard dans l'essai de l'homme ^8-10 études cliniques. Afin d'être en mesure de détecter des différences significatives dans une étude exp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Fabricant	Informations de commande
Les tests comportementaux
Rota-Rod pour souris	Ugo Basile, Comerio, Italie	# 47600
Dispositif de suspension de fil	Fait sur mesure
Préparation de la moelle épinière
Table d'opération Témoin de fonctionnement Gants de protection
"Iris" Ciseaux, inclinés à l'autre	Outils scientifiques, des Beaux-Heidelberg, Allemagne	14063-09
Ciseaux Spring Cohan-Vannas, les droites	Outils scientifiques, des Beaux-Heidelberg, Allemagne	15000-10
Micro pince	Hammacher, Solingen, en Allemagne	HWC 111-10
Scalpel "präzisa plus»	Dahlhausen, Köln, Allemagne	11.000.00.510, la figure 10