Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Résumé

La spectroscopie Raman est une technique appropriée pour le contact non-, sans étiquette analyse de cellules vivantes, de l'ingénierie tissulaire constructions et des tissus indigènes. Source spécifiques empreintes spectrales peuvent être générées et analysées en utilisant une analyse multivariée.

Résumé

Technologies non-destructive, sans contact et sans étiquette pour surveiller cultures cellulaires et tissulaires sont nécessaires dans le domaine de la recherche biomédicale. ^1-5 méthodes de routine Cependant, actuellement disponibles nécessitent des étapes de traitement et de modifier l'intégrité des échantillons. Spectroscopie Raman est un procédé rapide qui permet la mesure d'échantillons biologiques, sans la nécessité d'autres étapes de traitement. . Cette technologie à base de laser détecte la diffusion inélastique d'une lumière monochromatique ⁶ tant chaque vibration chimique est affecté à une bande de fréquences spécifique Raman (nombre d'onde en cm ^-1), chaque échantillon biologique comprend un motif typique spectrale en raison de leur composition biochimique inhérente ^{7. - 9} Dans les spectres Raman, les intensités des pics en corrélation avec le montant des obligations actuelles moléculaires. ¹ Similitudes et différences des ensembles de données spectrales peuvent être détectés en utilisant une analyse multivariée (par exemple l'analyse en composantes principales (ACP)) ^10. Ici, nous effectuons la spectroscopie Raman de cellules vivantes et de tissus natifs. Les cellules sont ensemencées sur des boîtes soit à fond de verre ou maintenues en suspension dans des conditions normales de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO ₂₎ avant la mesure. Tissus autochtones sont disséqués et conservés dans un tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C des mesures préalables. En fonction de notre dispositif expérimental, nous avons alors soit porté sur le noyau de la cellule ou de la matrice extracellulaire (ECM) des protéines telles que l'élastine et du collagène. Pour toutes les études, un minimum de 30 cellules ou 30 points aléatoires d'intérêt au sein de l'ECM sont mesurés. De données des étapes de traitement de soustraction du fond incluses et la normalisation.

Protocole

1. Préparation de l'échantillon biologique

1. Préparation de cellules vivantes
   1. Préparation de cellules adhérentes
      1. Semences dans les cellules in vitro-culture ou fraîchement isolées sur un plat à fond de verre (Greiner BioOne / Allemagne) et les incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ jusqu'à ce que la fixation des cellules est terminée.
      2. Retirer milieu de culture et laver doucement trois fois avec du PBS mesure préalable. Maintenir les cellules couvertes avec soit PBS ou milieu de culture cellulaire pendant toute la procédure de mesure.
   2. Préparation de cellules en suspension
      1. Détachez in vitro des cellules cultivées selon des protocoles communs (par exemple la trypsine-EDTA, raclage cellulaire), centrifuger les cellules et remettre en suspension le culot cellulaire obtenu dans du PBS ou un milieu de culture cellulaire.
      2. Transférer 100 ul de la suspension cellulaire (concentration: max. 100.000 cellules / ml) à un plat à fond de verre.
2. Préparation de la nattissus ive
   1. Après la récolte, les tissus, les transférer à stérile, PBS glacé et de les conserver plus de 12 heures à 4 ° C ou sur la mesure de la glace avant. Des expériences antérieures ont montré qu'une durée de conservation prolongée (temps d'ischémie froide de plus de 12 heures à 4 ° C) a entraîné des modifications spectrales dues à des processus de dégradation naturelle.
   2. Les mesures doivent être effectuées avec le tissu recouvert de PBS ou moyen pour éviter d'endommager des protéines de la MEC et les cellules en raison de séchage des tissus.

2. Raman spectromètre

Notre spectromètre Raman personnalisée combine un microscope standard à fluorescence (Olympus IX 71) avec un spectromètre Raman qui permet la comparaison directe des images lumineuses sur le terrain-et la fluorescence avec les spectres Raman. L'ensemble de base se compose d'un laser à 784 nm diode (Toptica photonique AG / Allemagne), un filtre à encoche pour la séparation de la lumière Raman diffusée de-la lumière d'excitation, un microscope unend a. spectrographe (Kaiser Systems Inc optique, Ann Arbor / USA) avec un dispositif à couplage de charge (CCD) optimisé pour la détection de l'information spectrale (F-voir de systèmes d'imagerie soft / Allemagne)

3. Contrôle de la fonction laser

1. Démarrez le logiciel Andor Solis (Andor / Royaume-Uni) et régler la température de la caméra CCD à -60 ° C afin de minimiser le bruit causé par les courants induits thermiquement dans la caméra.
2. Placer une plaquette de silicium sur la platine du microscope pour la procédure d'étalonnage.
3. Allumez le laser et régler la puissance de 85 mW.
4. Utilisez la Cellule logiciel B (Olympus / Allemagne) pour focaliser le laser sur la plaquette jusqu'à ce XY apparaît.
5. Mesurer la plaquette de silicium avec un temps d'intégration unique de 1 sec à l'aide d'un objectif 60x air.
6. Changer l'unité de l'axe des x de nombre de pixels à décalage Raman (cm ^-1) dans le logiciel Andor Solis.
7. Variez la focalisation du laser du pic de silicium à 520 cm ^-1 dansl'collectées spectre afin de trouver l'intensité maximale possible pour cette bande Raman. Le montant minimum de chefs d'accusation doit être supérieure à 11.000 à avoir un calibrage réussi.

4. Raman des mesures spectroscopiques

Toutes les mesures sont réalisées à température ambiante.

1. Les réglages de base
   1. Utilisez un objectif 60x de l'eau d'immersion (Olympus / Allemagne) avec une ouverture numérique de 1,2 pour recueillir le spectre des échantillons.
   2. Modifiez les paramètres d'acquisition de 10 intégrations / 10 secondes pour un total de 100 secondes par des mesures.
2. Mesure de cellules adhérentes
   1. Sortez le plat à fond de verre avec les cellules et le placer sur la platine du microscope.
   2. Afin d'obtenir un meilleur signal et garantir la reproductibilité, le laser se concentrer sur le noyau de la cellule, tourner à la lumière du microscope hors tension et commencer à recueillir le spectre.
   3. Mesurer un spectre de référence de l'e fond10 spectres très en déplaçant la focalisation du laser à côté de la cellule. Il est important de considérer que lorsque vous changez le focus un nouveau fond doivent être collectées pour chaque profondeur de champ.
3. Mesure des cellules en suspension
   1. Transférer 100 ul de la suspension cellulaire dans le plat à fond de verre et le placer sur la platine du microscope.
   2. La mise au laser sur le centre de la cellule, tourner à la lumière du microscope hors tension et commencer à recueillir le spectre.
   3. Mesurer un spectre de référence de l'arrière-plan tous les 10 spectres en déplaçant la focalisation du laser à côté de la cellule. Lorsque vous changez le focus, un nouveau fond doivent être collectées pour la profondeur nouvelle orientation.
4. Mesure des tissus indigènes
   1. Prenez l'échantillon et le placer dans un plat à fond de verre. La région d'intérêt (ROI) devrait être orientée vers le bas de la parabole.
   2. Remplissez le plat avec suffisamment de PBS pour couvrir l'échantillon.
   3. Placez un couvercle en verre sur l'échantillon afin d'éviter toute movement de l'échantillon pendant les mesures.
   4. Définir la focalisation du laser dans la structure d'intérêt (résolution en profondeur est laser et le tissu-dépendant) et commencer à recueillir les spectres.
   5. Collecter un spectre de référence de l'arrière-plan à chaque spectres 10 en déplaçant le laser focaliser sur la zone de tissu ensemble. Lorsque vous changez le focus, un nouveau fond doivent être collectées pour la profondeur nouvelle orientation.
5. Mesure de l'immunofluorescence (IF)-étiquetés cryosections
   1. Section frais, des échantillons de tissus composant logiciel enfichable congelés en utilisant une norme cryotom et les monter sur des lunettes de couverture de silice revêtues.
   2. Colorer les cryocoupes suivant un protocole de routine pour SI, employant seulement une étape de fixation court (max. 10 minutes avec le paraformaldéhyde 4%) et en utilisant des anticorps appropriés pour la détection de la protéine d'intérêt.
   3. Effectuer des mesures Raman se concentrant dans la région où se produit la fluorescence.
6. Expériences dégradation de l'élastine
   1. PlaCE l'ventricularis des feuillets porcine disséqués valve aortique (élastine-riche, le sang d'entrée du côté de la couche de valve de valvule cardiaque) faisant face au fond de la cuvette fond de verre.
   2. Mesurer le tissu natif comme un «non incubé de contrôle» à 30 points aléatoires à travers toute la surface du tissu se concentrant dans les structures fibrillaires.
   3. Diviser l'échantillon en 3 sections et les placer dans des tubes Eppendorf 2,5 distincts ml remplie avec 2 ml d'une solution d'élastase (5 U / ml, Worthington / Allemagne).
   4. Incuber le tissu pour 15 ou 30 minutes à 37 ° C.
   5. Après une incubation de 15 ou 30 minutes, retirer les tissus du tube Eppendorf et laver soigneusement avec du PBS pour arrêter complètement la réaction enzymatique.
   6. Mesurer chaque échantillon à 30 points aléatoires, en se concentrant dans les structures fibrillaires.

5. Traitement et analyse des données

1. Le traitement des spectres Raman
   Le pré-traitement de l'spectres générés a été réalisée en utilisant le logiciel OPUS (Bruker Optik GmbH / Allemagne).
   1. Afin de réduire les signaux parasites du verre et moyennes ainsi que pour éviter des variations provoquées par les changements de l'orientation au cours de mesures, soustraire le spectre de bruit de fond correspondant à partir des spectres recueillis.
   2. Réduire les spectres de la région entre les nombres d'onde 400-1800 cm ^-1, ce qui offre la plus grande quantité d'informations.
   3. Si nécessaire, normaliser le spectre du pic maximum. Facteurs de normalisation sur les fluctuations d'intensité et les échecs systématiques, ce qui simplifie la détection des changements structurels dans les spectres de l'échantillon.
   4. Effectuer une correction de base pour accroître la comparabilité entre les différentes expériences.
2. L'analyse des spectres Raman
   Les spectres Raman ont été analysées à l'aide APC avec The Unscrambler (CAMO / Norvège) du logiciel. Cette analyse multivariée détecte les différences et les similitudes au sein des données spectralesensembles. Chaque spectre est tracé comme un seul point dans un espace multidimensionnel basé sur les chiffres recueillis pour chaque quart de travail Raman. Chaque composante principale (PC) décrit une certaine quantité de l'information totale contenue dans les données originales. Le premier PC est celui qui contient la plus grande source de variation. Chaque PC contient ce qui suit, dans l'ordre, moins d'informations que la précédente. Chaque variable a un score et un chargement sur chaque PC. En traçant PC (= scores), les corrélations d'échantillon importantes peuvent être exposés. Les charges de décrire la contribution de chaque variable analysée à l'APC.
   1. Étiquetez chaque groupe de mesures par la création de gammes de ligne pour chaque groupe d'échantillons.
   2. Utilisez les réglages de base suivants pour l'APC: ski de validation, l'algorithme NIPALS, pas de rotation et de commencer l'analyse. Ces paramètres sont des spectres dépend.
   3. Effectuez l'APC.

6. Les résultats représentatifs

Raman spECTRA générée à partir de cellules adhérentes révèlent souvent un faible rapport signal-sur-bruit et un signal de faible intensité globale (Fig. 1) ^11. En raison du fait que la focalisation du laser doit être situé à proximité du fond de verre, l'influence de l'interférence signal de verre est assez élevé, ce qui provoque de masquage du signal réelle de l'échantillon. Par conséquent, le signal de l'échantillon peut être réduite ou même éliminée au cours d'une arrière-plan après la soustraction. Ainsi, nous préférons utiliser des cellules en suspension pour notre analyse spectroscopique Raman, car ils permettent la détection de plus amples renseignements spectrale détaillée. Cependant, les spectres de cellules adhérentes et la suspension présentent les mêmes pics principaux ne diffèrent que par leurs intensités.

Pour la caractérisation des différents types de cellules au sein d'une suspension, pas de pré-traitement est nécessaire. Les spectres Raman moyenne et les écarts types de fibroblastes humains, les cellules souches mésenchymateuses (CSM), les chondrocytes et les kératinocytes mesurée en suspension sontreprésentée sur la figure 2. Tous les spectres Raman ont une structure similaire, avec des pics provenant de biomolécules typiques tels que les protéines, les acides nucléiques et des lipides (voir tableau 1). ¹² Pour ces types de cellules, la région spectrale entre 600 et 1800 cm ^-1 contient la plus pertinente l'information spectrale, par où les différences claires entre les sont détectables différents types de cellules (Fig. 2A). Exemplaire, nous avons souligné une région spectrale (1280-1350 cm ^-1) affichant de nettes différences structurelles, ce qui n'est plus assignable à des vibrations moléculaires de collagène et des lipides. En revanche, les analyses morphologiques ne sont pas adaptés pour l'identification et la distinction de la plupart des cellules (Fig. 2B-I). Bien que la différence entre les chondrocytes et les cellules de la peau est observable (Fig. 2D, H par rapport à B, F et E, I), les fibroblastes et les MSC sont difficiles à séparer en utilisant uniquement champ lumineux micrsocopier (Fig. 2B, F par rapport à C, G) ^13.

Raman analyse spectroscopique de tissu natif, en particulier des protéines ECM, exige que le retour sur investissement peut être visualisée par imagerie à champ clair afin d'être en mesure de se concentrer sur la structure respective. Pour l'attribution d'une protéine à un large empreinte spécifique, nous avons généré des spectres Raman disponibles dans le commerce des protéines pures et cryosections immunohistologically colorées. Ici, nous avons identifié les spectres d'empreintes digitales des fibres élastiques dans les tissus natifs comparant élastine lyophilisée et immunofluorescence tachés de cryosections employant un anticorps dirigé contre l'élastine. Cependant, depuis l'élastine dispose d'un autofluorescence élevée, ce qui se reflète dans les spectres Raman, l'analyse des données est difficile (figure 3A). Afin de réduire l'échec systématique due à l'échantillon des propriétés spécifiques telles que l'autofluorescence, un traitement approprié des ensembles de données est cruciale. Dans nos données, unealyses, nous avons utilisé la normalisation afin d'éliminer l'intensité du signal significativement plus élevé de la protéine pure élastine, et donc, nous étions en mesure de générer comparables spectres Raman (Fig. 3B). L'élastine est une des protéines de la MEC les plus stables dans le corps et est donc très difficile à se dégrader. ¹⁴ Dans notre dispositif expérimental, nous avons provoqué la dégradation de l'élastine dans les tracts porcine sains de la valve aortique en effectuant une digestion enzymatique. L'application de l'analyse multivariée PCA, nous avons identifié des différences significatives entre les spectres Raman de enzymatiquement échantillons traités et les contrôles natifs (figure 3C). Ces différences spectrales ont été observées dans le spectre de chargement à 861, 1003 et 1664 cm ^-1. Attendus des changements structurels dans les fibres d'élastine contenant dus aux délais de exposition prolongée à l'élastase ont été présentés par coloration HART (fig. 4), qui ont également été traduit dans plus de groupes distincts marquer séparables (Fig. 3C).

Figure 1. Moyenne des spectres Raman des fibroblastes détachées et adhérente.

Figure 2. (A) moyenne des spectres Raman et écarts-types des quatre différents types de cellules primaires isolées (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les kératinocytes). La trame met en évidence la région spectrale de 1280 - 1350 cm ^-1 avec des différences de structure. (BE) Bright images en champ de détachés (B) des fibroblastes, (C) MSCS, (D) et les chondrocytes (E) kératinocytes. La barre d'échelle est égal à 20 um. (FI) à champ clair des images de adhérentes (F), des fibroblastes (G) MSCS, (H) et les chondrocytes (I) kératinocytes. La barre d'échelle est égal à 200 um.

Figure 3. (A) des spectres Raman sans normalisation des lyophilized élastine (ligne bleue), immunofluorescence (IF)-étiquetés cryosections (ligne orange) et des fibres élastiques (ligne rouge) mesurées dans les natifs des tracts de la valve aortique. L'intensité du signal élevé de l'élastine lyophilisée est causée par autofluorescence. (B) des spectres Raman après la normalisation en vue d'éliminer les défaillances systémiques. (C) Les scores et les charges de la comparaison entre la non-traitée de contrôle (rouge) et enzymatiquement dégradé (bleu et vert) fibres élastiques au sein du tissu natif.

Figure 4. HART's tachés tracts porcine valve aortique. Les fibres élastiques sont visualisées en noir. (A) et (B) démontrer la non-traité le contrôle et (C) et (D) représentent des échantillons de tissus qui ont été exposés à l'élastase enzyme dégradant pour l'élastine-30 minutes.

Nombre d'onde en cm -1	Affectation 12
717-719	CN	Les phospholipides
785-788	ADN / ARN de bases, Épine dorsale OPO	ADN / ARN
1003 - 1005	Phénylalanine	Protéine
1220-1280	Amide III	Protéine
1445-1447	CH 2	Protéine / lipide
1655-1680	Amide IC = C	Des lipides Protéines

Tableau 1. Bandes Raman qui sont détectés dans les spectres de tous les types de cellules (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les kératinocytes).

Discussion

La spectroscopie Raman est un outil approprié pour analyser les échantillons biologiques, tels que in vitro des cultures de cellules et des protéines ECM ainsi que les cellules dans les tissus natifs. ^11,15,16 Ici, nous avons démontré que ce contact non, sans étiquette technique permet la la discrimination des différents types de cellules et la détection de la dégradation des protéines ECM fondée uniquement sur la composition biomoléculaire intrinsèque de ces échantillons biologiques.

Le principal avantage de la spectroscopie Raman est la capacité à quantifier de manière non invasive l'empreinte biochimique d'un échantillon par son spectres Raman qui en résulte. Contrairement à la spectroscopie infrarouge, ce qui donne des informations similaires, les spectres Raman peuvent être recueillies à partir d'échantillons aqueux, comme la dispersion Raman de l'eau est faible. En outre, la spectroscopie Raman est uniquement sur la base de la détection de la rétrodiffusion de la lumière monochromatique, par conséquent, aucun traitement d'échantillonnage est nécessaire de mesure précédent. Ces attributs font de Raspectroscopie homme une alternative prometteuse pour le potentiel dans les applications d'imagerie in vivo. À ce sujet, anti-Stokes cohérente spectroscopie Raman (CARS) est une technique très intéressante car elle permet d'accélérer et d'acquisition plus sensible des données basées sur les mêmes signaux vibratoires utilisés dans nos expériences. ^15,16 D'autres méthodes alternatives, y compris multiphotonique induite par autofluorescence et imagerie de seconde génération d'harmoniques ont déjà été avérée appropriée pour le suivi des échantillons biologiques non invasive ou minime ^17. Cependant, ces modalités d'imagerie sont associés à des coûts très élevés et sont limités à autofluorescence génératrices de molécules. En outre, spectromètre Raman est facile à combiner avec microscopes optiques conventionnels. Ces caractéristiques font de la spectroscopie Raman un outil précieux pour étudier des échantillons biologiques dans les environnements physiologiques.

Une des limites actuelles de notre spectroscopie Raman est mis en placela mise au point laser relativement petite (250 nm au maximum à moitié pleine largeur (FWHM) latérale et 700 nm FWHM axiale) qui est créé par un objectif à grande ouverture numérique (NA = 1,2). Même si une grande ouverture numérique permet de couvrir une bonne quantité de la lumière émise Raman cédant dans un fort rapport signal sur bruit, la haute NA ne produit qu'une petite collection accent sein de l'échantillon qui est généralement beaucoup plus petite qu'une cellule. Afin de comparer les spectres Raman de différentes cellules, la collection d'un éventail représentatif est essentiel, qui est difficile à obtenir avec une zone de petit foyer. Pour résoudre ce problème, nous travaillons sur un processus visant à automatiser la collecte de signal à différents points de la cellule (= cartographie spectroscopique Raman), résultant en une moyenne spectrale et se livrant à un éventail représentatif. En outre, cette technique vous donnera un aperçu de la répartition des bandes Raman spécifiques, par exemple de la distribution des protéines dans une cellule.

Bioléchantillons LOGIQUE sont très complexes et se composent d'un mélange hétérogène de biomolécules qui contribuent à la spectres Raman recueillis. Par conséquent, le motif spectrale est grande complexité et la surveillance d'un type unique d'une molécule dans un spectre Raman est difficile à atteindre avec le chevauchement de signaux différents molécule. En outre, la fluorescence intrinsèque de l'échantillon peut masquer des informations précieuses sur les plus faibles signaux Raman. Fait intéressant, dans certains de nos études précédentes, nous avons identifié autofluorescence dans les spectres Raman comme le principal facteur de différenciation entre les types cellulaires (cellules souches mésenchymateuses et les fibroblastes) en utilisant un outil d'analyse appropriée ^13. Nous avons également identifié que les changements dans l'intensité du signal Raman globale peut servir un indicateur de l'état de collagène et des fibres de collagène au sein de l'ECM de tracts de la valve aortique. ⁹ Toutefois, lorsque l'on analyse l'état de l'élastine dans ces tissus, nous n'étions pas en mesure de détecter des résultats similaires. Comme mentionné dans le résultatla section s, nous étions seulement capables de détecter des altérations de bandes spécifiques Raman dans les échantillons traités par l'élastase par rapport aux contrôles natifs. Nous n'avons pas vu une diminution du signal global Raman dans les échantillons traités par voie enzymatique comme prévu. Ces observations entraîné dans un complot score qui n'a pas révélé de la formation de grappes clair comme on le voit dans l'étude précédente. ⁹ En revanche, l'influence du traitement enzymatique est détectable dans les résultats de l'ACP. Nous supposons que ces divergences entre les deux protéines de la MEC, l'élastine et le collagène, sont basées sur les différences morphologiques et différents processus de dégradation enzymatiques: dans le dépliant de la valve aortique, la zone riche en collagène (fibreuse) est une couche continue qui devient desserré en raison de la traitement enzymatique, grâce à quoi l'élastine contenant la zone (ventricularis) présente une configuration de réseau qui apparaît après une exposition à une fragmentation de l'élastase (fig. 4). Des mesures ponctuelles simples ne sont donc pas appromangé à détecter de telles ruptures de petits au sein du réseau d'élastine. Ici, une cartographie Raman du tissu aiderait à identifier les pannes de réseau.

Un autre défi en spectroscopie Raman d'échantillons biologiques est de réduire les temps de mesure. Une solution consiste à augmenter la puissance du laser, qui est adapté aussi longtemps que les échantillons biologiques ne sont pas affectés par la photo-dommages. Toutes nos expériences actuelles sont la preuve de principe des études portant sur ​​la recherche fondamentale, mais notre objectif global est de mettre en œuvre la spectroscopie Raman pour des applications cliniques, y compris la médecine régénérative (contrôle de la qualité par exemple de l'ingénierie tissulaire produits), suivi du greffon pré-transplantation et le diagnostic du cancer.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
élastase	Worthington	LS006363
Anticorps anti-élastine	Sigma	HPA018111	1:75; tampon citrate
PBS	Lonza	17-512F
plats à fond de verre	Greiner BioOne	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker