Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l'étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d'écoulement

Résumé

Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Résumé

Les neutrophiles sont le type le plus abondant de globules blancs. Ils constituent une partie essentielle du système immunitaire inné ^1. Au cours de l'inflammation aiguë, les neutrophiles sont des cellules inflammatoires premiers à migrer vers le site de la lésion. Le recrutement des neutrophiles à un site de la lésion est un processus par étapes qui comprend d'abord, la dilatation des vaisseaux sanguins pour augmenter le flux sanguin, en deuxième lieu, les changements structurels microvasculaires et d'échapper à des protéines plasmatiques de la circulation sanguine, en troisième lieu, le laminage, l'adhérence et la transmigration des neutrophiles dans l'ensemble du accumulation et quatrième neutrophiles au site de la lésion ^2,3; endothélium. Un large éventail de in vivo et in vitro a évolué pour permettre l'étude de ces ⁴ processus. Cette méthode met l'accent sur la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales humaines.

Une méthode populaire pour l'examen des processus moléculaires impliqués dans la transmigration des neutrophiles utilise humaine neutrophils interagissant avec les cellules humaines primaires endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) ^5. L'isolement des neutrophiles a été décrit visuellement ailleurs ^6; donc cet article vous montrera la méthode pour l'isolement de cellules HUVEC. Une fois isolées et cultivées à confluence, les cellules endothéliales sont activées aboutissant à la régulation à la hausse des molécules d'adhésion et l'activation. Par exemple, l'activation des cellules endothéliales avec des cytokines telles que le TNF-alpha entraîne la E-sélectine augmenté et IL-8 expression ^7. E-sélectine médie de capture et le laminage de neutrophiles et d'IL-8 et d'activation de médiateur d'adhérence ferme de neutrophiles. Après neutrophiles adhérence transmigrer. Transmigration peut se produire paracellularly (à travers les jonctions des cellules endothéliales) ou transcellularly (à travers la cellule endothéliale elle-même). Dans la plupart des cas, ces interactions se produisent dans des conditions d'écoulement trouvés dans le système vasculaire ^7,8.

La chambre de plaques parallèles de débit est un système largement utilisé que mile cisaillement hydrodynamique micros contraintes trouvé in vivo et permet l'étude du recrutement des neutrophiles dans des conditions d'écoulement in vitro ^9,10. Plusieurs entreprises produisent parallèles chambres d'écoulement de la plaque et ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients. Si fluorescente imagerie est nécessaire, en verre ou en une optiquement similaire polymère doit être utilisé. Les cellules endothéliales ne poussent pas bien sur le verre.

Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour l'imagerie à contraste de phase, DIC et de la transmigration des neutrophiles fluorescente utilisant une lame de faible volume canal ibidi constitué d'un polymère qui prend en charge l'adhérence et la croissance rapides des cellules endothéliales humaines et a des qualités optiques qui sont comparables à verre. Dans cette méthode, les cellules endothéliales ont été cultivées et stimulées dans une μslide ibidi. Les neutrophiles ont été introduits dans des conditions d'écoulement et de la transmigration a été évaluée. L'imagerie de fluorescence des jonctions activé en temps réel de détermination de l'étendue de paracellulaire par rapporttransmigration transcellulaire.

Protocole

1. L'isolement et la maintenance des cellules endothéliales vasculaires humaines

1. Niveau 2 procédures de biosécurité doit être utilisé lorsque l'on travaille avec du sang et de tissus humains. L'aide de ciseaux couper le cordon du placenta, puis d'examiner de près le cordon de caillots sanguins et les dommages causés par le clampage du cordon pendant l'accouchement. Couper et jeter ces parties de la moelle.
2. Préparer la solution de collagénase fraîche à 1 mg / ml en versant 50 ml de tampon cordon chaud dans un tube qui contient 50 mg de la collagénase.
3. Changement dans les gants stériles et d'ouvrir un plateau à instruments stérilisés autoclavé contenant canules mousses, pinces, ciseaux, de la moelle à trois voies robinets d'arrêt et de la gaze dans une hotte à flux laminaire.
4. Identifier les deux artères et du présent seule veine dans la moelle. Les artères sont plus petits et ont tendance à être étroitement resserré, tandis que la veine est grand et facile à cathétériser. Pour vider le sang de la veine, insérer doucement une canule d'un robinet à deux voies qui s'y rattachent into une extrémité de la veine et le lieu d'une pince autour de la canule pour le maintenir fermement en place. Perfuser tampon cordon à travers la veine. Répétez jusqu'à ce que l'écoulement à travers est clair, puis serrer l'extrémité de la corde.
5. Collagénase perfuser dans la veine, fermer le robinet, placez le cordon dans un bécher contenant un tampon cordon chaud et incuber pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirez le cordon et masser doucement le cordon pour desserrer les cellules endothéliales de la lumière de la veine. Videz la solution dans le tube contenant des cellules endothéliales des médias (ECM). Rincer avec un tampon de cordon à deux reprises pour éliminer les cellules restantes. Videz la solution dans le même tube.
6. Centrifuger les cellules à 350 xg pendant 10 minutes à granulés les cellules endothéliales.
7. Eliminer le surnageant et ajouter 10 ml d'ECM au culot. Resuspendre doucement les cellules de l'ECM, puis de transférer les cellules à un flacon T75 pré-enduit avec 0,2% de gélatine. Pré-revêtement avec de la gélatine a été fait pour au moins 1 heure à 37 ° C. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% De CO _2.
8. Le lendemain, secouez doucement le flacon pour déloger les globules rouges, puis enlever le surnageant et laver avec une solution chaude saline équilibrée de Hank (HBSS). Retirer HBSS et nourrir les cellules avec 10 ml d'ECM chaud. Examiner les cellules sous le microscope pour s'assurer que les globules rouges ont été retirés. Évaluer le degré de confluence et de la morphologie des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales à ce stade doit être allongée sans aucun signe de vacuoles.
9. Continuer à changer les médias tous les trois jours jusqu'à ce que les cellules atteignent confluence, les cellules, puis répartis en utilisant une solution de 0,08% de trypsine contenant 1 mM d'EDTA. Cellules endothéliales dans des boîtes de plaques désirées pré-enduit avec 0,2% de gélatine. Les cellules doivent atteindre la confluence en 3-6 jours.
10. Lorsque vous utilisez ibidi chambres, pré-couche chaque chambre avec 0,2% de gélatine. Enlever l'excès de gélatine et de la fibronectine, puis ajoutez 1,5 X 10 ⁶ / mL de cellules endothéliales en suspension dans l'ECM dans la chambre. Changer les médias tous les jours jusqu'à ce que confluent. Les cellules doivent être confluentes en 2-3 jours en fonction de la moelle.

2. Préparation de neutrophiles

1. Les neutrophiles ont été isolés à partir du sang périphérique de volontaires sains en utilisant la centrifugation de densité. Un protocole détaillé avec une démonstration visuelle pour l'isolement des neutrophiles peut être trouvée dans le numéro précédent de cette revue ^6. Une fois isolés, des cellules neutrophiles Resuspendre à une concentration de 1x10 ⁶ / ml dans du HBSS contenant 0,5% d'albumine humaine.

3. Mise en place de la Chambre ibidi

1. Cultiver les cellules endothéliales dans une chambre de la gélatine enduit ibidi. Examinez tous les jours en utilisant la microscopie à contraste de phase jusqu'à ce qu'ils deviennent bien confluentes.
2. Stimuler les cellules endothéliales pour augmenter l'expression des molécules d'adhésion et d'activation. Pour les fins du présent protocole, les cellules endothéliales sont stimulées avec 10 ng / ml de TNF recombinant-α pendant quatre heures à 37 ° C et 5% de CO _{2 avant la mise en place de la chambre ibidi pour l'imagerie dans des conditions d'écoulement.}
3. Préparer le microscope, et la pompe seringue comme décrit visuellement par Wiese et ses collègues ^{11 en} utilisant une chambre vide ibidi.
4. Principales différences entre ce protocole et la procédure Wiese inclure le pré-remplissage du tube pour prévenir l'exposition des cellules endothéliales dans l'air, le maintien de la mémoire tampon à 37 ° C en utilisant un bain d'eau, en utilisant des tubes PharMed de garder la mémoire tampon de perdre la température et l'utilisation de différents objectifs sur le microscope selon que l'imagerie à contraste de phase ou de fluorescence.
5. Une fois que le microscope est mis en place et le tube est rempli avec du HBSS, fermez toutes les robinets et de supprimer la chambre vide ibidi.
6. Connectez la chambre ibidi contenant du TNF-α stimulé les cellules endothéliales à la tubulure.

4. Le recrutement des neutrophiles et de la Transmigration

1. Visualisez la monocouche de cellules endothéliales dans le Microscope l'aide d'un objectif de phase 10x contraste.
2. Définir la pompe à seringue de retirer et de commencer l'écoulement de HBSS à la contrainte de cisaillement de consigne (typiquement entre 0,5 à 2 dynes / cm ^2).
3. Sur le côté de l'entrée, commutateur de HBSS à neutrophiles isolés (1x10 ⁶ / ml) en tournant la façon dont trois robinet.
4. Commencer l'enregistrement à l'aide d'une caméra CCD reliée soit à un enregistreur de DVD ou relié directement à l'ordinateur. Démarrer la minuterie lorsque les neutrophiles pénètrent dans la chambre. Perfuser neutrophiles pendant quatre minutes. Un total de 3 mL de la suspension de neutrophiles est suffisante pour une expérience unique.
5. Après quatre minutes, revenir à HBSS pour empêcher la fixation de nouveaux neutrophiles. Si les données concernant les interactions au total, le produit laminé et d'adhérence ferme sont souhaitées, image 6 champs aléatoires pendant 10 secondes chacune avec un objectif de phase 10x contraste entre 4 et 5 minutes.
6. Basculer vers un objectif 40x et d'enregistrer un seul champ de vue entre 5 et 10 minutes. A 10 minutes, recueillir desentre 5 et 10 champs de vue aléatoires.
7. Arrêter l'écoulement et de passer à la chambre suivante.

5. L'imagerie de fluorescence dans des conditions de débit utilisant une chambre d'ibidi

1. Cellules endothéliales ou l'étiquette soit neutrophiles avec une sonde fluorescente d'intérêt. Par exemple, un anticorps anti-VE-cadhérine conjugué à Alexa-[547] peut être utilisé pour visualiser jonctions des cellules endothéliales.
2. Assemblez chambre ibidi sur un microscope à contraste d'interférence différentiel (DIC) et des capacités fluorescentes. Nous utilisons un FluoView 1000 confocale (Olympus) avec une chambre de l'environnement. Concentrez-en utilisant un objectif conçu pour le travail DIC et fluorescente.
3. Acquérir des images simultanées DIC et les lampes fluorescentes à l'aide du logiciel fourni par le vendeur, tout en suivant le cours du temps décrit à la section 4.

6. Analyse du recrutement des neutrophiles

1. Analyse du matériel et d'interagir des cellules est décrite par Wiese et al ^11.
2. Pour mesurer le pourcentage de neutrophiles qui roulent sur la monocouche endothéliale compter le nombre de neutrophiles qui ont ému plus d'un diamètre de cellule dans une période de 5 secondes. Divisez ce chiffre par le nombre total de leucocytes dans le domaine afin de déterminer le pourcentage de cellules de roulement. Par extension, les cellules restantes sont considérées comme très adhérente.
3. Mesurer la vitesse de roulement de neutrophiles en calculant la distance parcourue dans le neutrophile une période donnée, puis en le divisant par ce temps en secondes.
4. Transmigration est déterminé en comptant le nombre de neutrophiles qui ont changé de forme et a migré au-dessous de la monocouche ^10. Ces neutrophiles sont identifiés par le fait qu'ils changent la phase d'être claire lorsqu'il est sur ​​le dessus de la monocouche d'être foncée de phase lorsque dessous de la monocouche ^10. Le nombre de cellules transmigré peut être exprimée en pourcentage des cellules totales dans le champ de vision ou en tant que première insensibleer des cellules transmigré par unité de surface. Dans ce système modèle, typiquement 50% de neutrophiles transmigrent après 10 minutes.

7. Les résultats représentatifs

Les cellules endothéliales non stimulées ne prend pas en charge le recrutement des neutrophiles. En revanche, la stimulation des cellules endothéliales avec le TNF-alpha dans les résultats des neutrophiles de roulement, l'adhérence ferme et la transmigration. Un exemple de ces données est montré dans les figures 1 et 2. La figure 1A montre les neutrophiles qui interagissent avec le TNF-α-cellules endothéliales stimulées. Ces interactions peuvent être quantifiés, révélant le nombre total de neutrophiles qui interagissent avec les cellules endothéliales ainsi que le nombre de neutrophiles roulants, adhérente ou transmigré (Figure 2). La transmigration des neutrophiles peut se produire au niveau des jonctions cellulaires ou par l'intermédiaire des cellules endothéliales elles-mêmes. Pour différencier ces deux conditions, les cellules endothéliales sont marquées avec un anti-VE-c anticorps adherin et la transmigration est marqué comme se produisant paracellularly ou transcellularly (figure 1B et C). Dans ce modèle, la quasi-totalité transmigration est paracellulaire ^7.

Figure 1. DIC simultanée et l'imagerie de fluorescence dans des conditions d'écoulement à l'aide d'une chambre ibidi. (A) image DIC fraîchement isolés neutrophiles humains qui migrent à travers les cellules endothéliales de veines ombilicales. Le jaune flèche montre un neutrophiles adhérente; la flèche blanche indique un neutrophile transmigrant. (B) jonctions des cellules endothéliales ont été colorées avec un anticorps anti-VE-cadhérine conjugué à Alexa-[547] et imagé. (C) montre superposition de canaux A et B révèle que la quasi-totalité transmigrant dans ce modèle est paracellulaire. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 2. Les cellules endothéliales ont été laissés non stimulées ou ont été stimulées avec 10 ng / ml de TNF-α. Après 4 heures, une chambre à plaques parallèles de débit a été assemblé et neutrophiles ont été perfusés à travers au 1 dyn / cm ^2. (A) les interactions neutrophiles ont été examinés et mesurés à l'aide du logiciel ImageJ du NIH. Les cellules en interaction totales ont été caractérisés comme (B) de roulement, adhérente ou (C) transmigrant. Les données représentent la moyenne + SEM comprise entre 3 et 5 expériences. La différence entre le contrôle et le TNF dans les panneaux A et C était significative (p <0,001).

Discussion

Les chercheurs ont systématiquement utilisé des cellules endothéliales à partir de différents lits vasculaires pour étudier le recrutement des neutrophiles et la transmigration. Les exemples incluent, mais ne sont pas limités à, des cellules endothéliales microvasculaires dermiques ^12, le foie les cellules endothéliales sinusoïdales ¹³ et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ^10. Parmi eux HUVEC acquis une grande popularité en raison de leur relative f...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif et le matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
La collagénase de type 1	Worthington	4197
Tampon cordon			Composition: NaCl 140 mM 4 mM de KCl 10 mM de D-glucose dans 1mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 à pH 7,4
Médias cellules endothéliales (ECM)			M199 avec des sels d'aigle supplémentés avec du sérum humain 16% contenant 100 unités de pénicilline 100 ug de streptomycine et de 0,3 mg de L-glutamine/ml
M199	GIBCO	31100-035
Le glutamate streptomycine pénicilline (100X)	Invitrogen	10378-016
Ibidi chambres	Ibidi	80606
TNF-α	Prepro Tech	300-01A
Solution d'albumine humaine 20%	Bioproduits Gemini	800120050
HBSS sans Ca 2 + et Mg 2 +	Sigma	H2487-10X
HBSS avec Ca 2 + et Mg 2 +	Sigma	H1387-10X