Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe

Résumé

Les circuits neuronaux sont topographiquement organisée en compartiments fonctionnels avec des profils spécifiques moléculaires. Ici, nous fournissons les étapes pratiques et techniques pour révéler la topographie du cerveau planétaire grâce à une approche polyvalente wholemount coloration immunohistochimique. Nous démontrons l'utilité de la méthode utilisant la cytoarchitecture bien compris et les circuits du cervelet.

Résumé

L'architecture répétée et bien compris cellulaire du cervelet en font un système modèle idéal pour explorer la topographie du cerveau. Sous-tend son cytoarchitecture relativement uniforme est un ensemble complexe de domaines parasagittales de gène et l'expression des protéines. Le cloisonnement moléculaire du cervelet est reflétée par l'organisation anatomique et fonctionnelle des fibres afférentes. Pour apprécier pleinement la complexité de l'organisation du cervelet que nous avons déjà une approche affinée coloration wholemount pour l'analyse à haut débit de défauts de structuration dans le cervelet de souris. Ce protocole décrit en détail les réactifs, des outils, et des mesures pratiques qui sont utiles pour réussir à révéler des modèles d'expression de protéines dans le cervelet de souris adulte en utilisant immunomarquage wholemount. Les étapes mis en évidence ici démontrer l'utilité de cette méthode en utilisant l'expression de zebrinII / aldolaseC comme un exemple de la façon dont la topographie fine de la cerveau peut être révélé dans sonnatif conformation tridimensionnelle. Sont également décrits des adaptations apportées au protocole qui permet la visualisation de l'expression des protéines dans les projections afférentes et cervelets grande pour des études comparatives de la topographie moléculaire. Pour illustrer ces applications, les données de coloration afférente du cervelet de rat sont inclus.

Protocole

1. Perfusion des animaux et de dissection Cervelet

1. Fonction de la protéine, la perfusion peut être essentiel pour ^1,2 coloration réussie. Perfusion transcardiaque est un invasive, non-survie procédure qui exige l'utilisation appropriée d'anesthésiques. Une formation correcte, l'approbation institutionnelle, et l'approbation du IACUC sont toutes nécessaires avant de tenter la procédure. Il ya toujours une bonne idée de consulter des vétérinaires de l'institution à obtenir de l'aide dans l'identification des exigences expérimentales et d'acquérir la formation appropriée. Avant la procédure, l'animal devrait être profondément anesthésiés et ne répond pas à des stimuli tels que la fièvre ou pincement de la queue. L'aide de ciseaux faire une coupe dans la peau de l'abdomen et la paroi musculaire, puis continuer à ouvrir la cage thoracique en coupant juste à côté du sternum de chaque côté. En outre, l'expérimentateur peut créer un plus grand espace de travail interne en coupant le fascia entourant le diaphragme. En soulevant la paroi abdominale et thoracique SuperIOrly, le cœur va maintenant être exposée. Faire une petite incision dans l'oreillette droite pour permettre au sang de s'écouler et immédiatement insérer l'aiguille de perfusion dans le ventricule gauche. Une pompe hydrostatique de base est préférable de fournir les solutions de perfusion (voir le tableau 1 pour plus de détails). Premièrement, rincer le sang avec une solution saline tamponnée de phosphate 0,1 M (PBS, voir tableau 3) jusqu'à ce que le liquide soit claire. Ensuite, éteignez la pompe hydrostatique, passer rapidement le tube de distribution de solution à un conteneur de paraformaldéhyde 4% (PFA, voir tableau 3) dilué dans du PBS, puis tourner la pompe de retour sur de livrer le fixateur. L'utilisation d'une pompe n'est pas nécessaire: la pratique, deux seringues rempli du PBS et 4% en PFA peut être utilisé pour fournir les solutions lentement.
2. Il est essentiel de bien disséquer le cerveau du crâne sans introduire de lésions aux tissus. Même petites lacérations au cerveau lors de la dissection va progressivement s'étendre dans les crevasses visibles queanticorps de piégeage et de provoquer une coloration artéfactuelle au cours du traitement du tissu (par exemple des astérisques rouges dans la figure 2). Pour les dissections cérébelleux, il est typique de couper la peau vers le bas au milieu de la tête et puis doucement taquiner les volets à part pour exposer le crâne. Couper le crâne d'avant en arrière le long de la ligne médiane dorsale, et également latéralement le long des deux côtés du crâne. Ne pas couper au-delà du bregma que cela risque d'entailler le cervelet. En utilisant des pinces soulevez doucement le front du crâne loin du cerveau en faisant attention de ne pas arracher les tissus du cerveau qui est attaché aux méninges. Sever les nerfs crâniens sur la face ventrale du cerveau.
3. Séparation du cervelet du reste du cerveau est importante pour deux raisons. Premièrement, elle permet l'exploration des profils d'expression dans les lobules antérieurs, qui sont cachés à la vue par le colliculi in situ. La seconde est que la séparation du tissu en plus petites, les régions isolées permet de mla fixation du minerai complète, ce qui peut faciliter la coloration de certaines protéines. Tout au long de cette étape de dissection finale, il faut prendre soin de ne pas toucher le cervelet avec les conseils de la pince. Insérez les pointes d'une paire de pince dans le milieu des colliculi supérieures et inférieures. Avec une deuxième série de pince lentement taquiner l'écart de la colliculi inférieure du cervelet. Ensuite, jeter le cervelet de sorte que sa face antérieure est tournée vers le bas et le tronc cérébral est pointée vers le haut. Insérez la pince dans le quatrième ventricule entre le tronc cérébral et les lobules IX / X du cervelet. Couper les pédoncules en pinçant avec les pinces sur les deux côtés, puis soulevez doucement le cervelet loin du tronc cérébral. Une fois que le cervelet est isolé, il post-fixer par immersion dans 4% PFA à 4 ° C pendant un minimum de 24-48 heures. Le cervelet peut être stocké dans 4% PFA pour une période de temps prolongée. Les méninges doivent être enlevés avant ou après coloration pour une meilleure visibilité des profils d'expression.Si l'expérimentateur choisit d'enlever les méninges avant la coloration il ya une forte possibilité que le cervelet sera entaillé au cours du processus. Éplucher les méninges à la fin de la procédure de coloration est beaucoup plus simple, car ils deviennent plus faciles à localiser après leur acquisition coloration de fond faible et devenir fragile post-traitement.

2. Traitement de la coloration de tissus pour Wholemount

Parce que l'approche coloration wholemount dure plus longtemps que la coloration immunohistochimique de coupes de tissus, il est utile de planifier le calendrier de chacune des expériences comme indiqué dans le calendrier par exemple fourni (tableau 2). Avant de commencer, il ya plusieurs choses importantes à garder à l'esprit. 1) Les microtubes contenant le tissu doit être tourné sur un nutator en tout temps, sauf pendant le processus de gel / dégel. 2) Plusieurs solutions doivent être frais pour chaque expérience (voir le tableau 3 pour les recettes en solution). 3)Tout au long du protocole, lors du changement de solutions, verser doucement la solution passe plutôt que de supprimer le cervelet avec une pince, pour éviter de toucher le cervelet. Puis, après mélange de la nouvelle solution dans un autre récipient, utiliser une pipette à ajouter lentement la solution fraîche au tube.

2.1 Jour 1:

1. Fixer le cervelet en ³ fix Dent à température ambiante pendant 6-8 heures à bascule doucement sur ​​le nutator. Si le méthanol est destructrice pour votre antigène, envisager de remplacer les étapes 2.1a 2.3a travers d'une méthode de récupération de l'antigène. La chaleur et les tampons utilisés pour l'extraction d'antigène aidera à préparer le tissu à la pénétration d'anticorps.
2. Bleach le cervelet dans Bleach Dent ³ de la nuit à 4 ° C.

2.2 Jour 2:

1. Déshydrater le cervelet en deux tours de 100% MeOH à température ambiante pendant 30 min chacun.
2. Puis, pour améliorer la pénétration des solutions, sous réservele tissu à une série de cycles gel / dégel. Placez délicatement le tube dans un récipient avec de la glace sèche et le gel pendant 30 min. Ensuite, retirer le tube et le laisser à température ambiante sur le banc pour 15 minutes. L'étape de congélation / décongélation doit être effectuée quatre fois (au moins).
3. Après le dernier dégel du tissu, placer le tube dans un congélateur à -80 ° C pendant la nuit.
4. Le tissu peut être stocké pendant de longues périodes de temps à -80 ° C, soit immédiatement avant ou après les étapes de congélation / décongélation. Sinon, le protocole doit être poursuivi.

2.3 Jour 3:

1. Réhydrater le cervelet en le lavant dans 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, et 100% pour les 60-90 minutes à température ambiante PBS.
2. Ensuite, pour les adultes de la souris cervelets, sous réserve du tissu à une digestion enzymatique avec la protéinase K 10μg/ml dans du PBS pendant 2-3 minutes. Aucune étape de digestion est nécessaire pour cervelets d'animaux jeunes (P5 ou moins chez la souris). Plus digestion est proposé pour un plus gros cerveau. Par exemple, la digestion peut être aussi élevé que 5-6 minutes pour les cerveaux de primates ^4.
3. Après digestion, les laver immédiatement du cervelet dans la PBS trois fois pendant 10 minutes à température ambiante pour enlever la protéinase K.
4. Bloquer le tissu en PMT (voir tableau 3) une nuit à 4 ° C. Lait en poudre est souvent le premier choix lors de la sélection d'un agent bloquant pour le travail de protéines, car elle est peu coûteuse, permet de réduire efficacement la coloration de fond, et n'est généralement pas interférer avec fixation de l'anticorps ou l'accès à l'antigène. Sérums animaux peuvent également être utilisés, bien que l'expérimentateur doit être conscient du coût ajouté et doit d'abord tester la qualité de sérum pour une réactivité croisée immunoglobulines et sa capacité à produire un signal optimal par rapport au bruit.

2.4 Jour 4-5:

1. Incuber le tissu dans les anticorps primaires dilués dans PMT complétées avec du DMSO 5% pendant 48 heures à 4 ° C (larger cervelets nécessitera une augmentation des temps d'incubation).

2.5 Jour 6:

1. Laver le cervelet 2-3 fois pendant 2-3 heures chacune dans les PMT à 4 ° C pour éliminer les anticorps non liés primaires.
2. Puis, incuber le tissu des anticorps secondaires dans une solution contenant PMT avec 5% de DMSO à 4 ° C pendant la nuit (plus cervelets peuvent nécessiter une augmentation des temps d'incubation).

2.6 Jour 7:

1. Laver le cervelet 2-3 fois pendant 2-3 heures chacune dans les PMT à 4 ° C.
2. Donnez le tissu un lavage final avec PBT (voir tableau 3) pendant 1-2 heures. Cette étape supprime excès de lait et améliore la clarté de la coloration.
3. Enfin, incuber le tissu en DAB (3,3 '-diaminobenzidine) solution jusqu'à ce que l'intensité de la coloration optimale est atteinte. Le produit de réaction marron doit être clairement visible dans les ~ 10 minutes. Il est préférable d'utiliser DAB dans l'obscurité que la lumière provoque la précipitation d'chromogènete, ce qui peut augmenter la coloration de fond.

2.7

Lorsque l'intensité de coloration optimale est atteinte, arrêter la réaction en plaçant le cervelet dans du PBS avec de l'azoture de sodium 0,04%. Le tissu peut être stocké à long terme dans cette solution. L'azoture de sodium est un inhibiteur puissant de la croissance bactérienne, mais devrait être évitée jusqu'à ce que cette étape car elle inhibe également la peroxydase de raifort.

2.8 procédure d'amplification en option:

suivre le protocole normal, mais ces étapes doivent être effectuées en place de mesures 2.5b-2.7 ci-dessus.

1. Incuber le tissu une nuit à 4 ° C en biotine-anticorps secondaires conjugués à PBST (voir tableau 3) avec 5% de DMSO.
2. Rincer le tissu pendant 2-3 heures chacune dans les changements de 3-4 PBST à température ambiante.
3. Incuber le cervelet une nuit à 4 ° C dans ABC solution complexe dans le PBST.
4. Rincer le tissu pendant 2-3 heures chacun àtempérature ambiante dans les changements de 3-4 PBS.
5. Incuber le tissu dans une solution de DAB fraîchement préparés, comme décrit ci-dessus.
6. Lorsque la coloration est optimale, arrêter la réaction par un lavage du cervelet dans du PBS avec l'azoture de sodium 0,04%.

3. Imagerie du tissu coloré

1. Images Wholemount peut être capturé par l'aide, par exemple, un Leica DFC3000 FX caméra montée sur un stéréomicroscope Leica MZ16 FA en cours d'exécution Leica Application Suite FX logiciel. Si vous le souhaitez, la microscopie déconvolution peut être utilisé pour acquérir plusieurs images consécutives dans les différents plans focaux, avec chaque image ayant seulement un lobule unique mise au point nette. Puis, les images peuvent être compressées en une seule pile et les logiciels rendus à éliminer les distorsions. L'image finale composite illustrent les profils d'expression de surface du cervelet avec tous les motifs visibles dans orientation claire.
2. Tissu coloré Wholemount devrait être imagée tout en étant immergé dans du PBS (ou tout autre support qui donnera uneindice de réfraction optimale). Afin de positionner facilement l'wholemount pour l'imagerie, faire un gel d'agar à 1% dans un plat de Petri en plastique. Coupez de petits trous dans le gel. Les trous permettra le cervelet pour être coincée dans l'orientation désirée.
3. Les données brutes sont importées dans Adobe Photoshop CS4 et ajusté pour les niveaux de contraste et la luminosité.

Animaux

Toutes les études animales ont été effectuées en vertu d'un protocole sur les animaux IACUC approuvé conformément aux directives institutionnelles à l'Albert Einstein College of Medicine. Mâle et femelle consanguine suisse Webster (Taconic, Albany, NY) chez la souris ont été maintenues dans notre colonie et utilisé pour toutes les études. Rats adultes euthanasiés ont été aimablement fournies par le Dr Bryen Jordanie (Albert Einstein College of Medicine). Tous les animaux étaient au moins un mois.

4. Les résultats représentatifs

Le cervelet est compartimenté par l'expression moléculaire dans quatre zones transversales:la zone antérieure (A à Z: ~ lobules IV), la zone centrale (CZ: ~ lobules VI-VII), la zone postérieure (PZ: ~ lobules VIII-IX dorsale) et la zone nodulaire (NZ: ~ lobules IX et X ventrale ) 5. Chaque zone contient un ensemble unique de parasagittale rayures ^1,2,5,6 (Fig. 1). Expression dans les cellules de Purkinje ZebrinII révèle rayures dans le AZ et PZ (Fig. 2) et d'expression uniforme dans la CZ et néo-zélandais (Fig. 2). L'organisation parasagittale des cellules de Purkinje est reflété par la topographie champ terminal de fibres afférentes. Transcription de la cocaïne et les amphétamines-régulée (CART) peptide est exprimé en sous-ensembles de fibres grimpantes (Fig. 3a) que le projet de rayures de dendrites des cellules de Purkinje dans la couche moléculaire du cervelet cortex ⁷ (Fig. 3b). Avec les modifications appropriées, telles que l'amplification ^7, le protocole permet wholemount pour la visualisation de modèles olivocerebellar sans le necD pour une laborieuses, le temps des reconstructions de la consommation des coupes de tissus de coloration (Fig. 3b).

Figure 1. A. ZebrinII / aldolaseC expression révèle des bandes sagittales dans les sections transversales du cervelet. Échelle = 500 um. B. ZebrinII / aldolaseC est exclusivement exprimée dans soma des cellules de Purkinje et les dendrites. Échelle bar = 150μm (gl = couche granulaire; pcl = couche de cellules de Purkinje; ml = couche moléculaire).

Figure 2. Un cervelet wholemount colorées pour ZebrinII / aldolaseC montrant des bandes des cellules de Purkinje dans les images de la partie antérieure (AZ), centrale (CZ) et postérieures (PZ) zones du cervelet. Ici, nous montrons également un exemple de la conséquence négative de entailler le cervelet. La coloration résulte un artefact est indiquéavec des astérisques rouges. La barre d'échelle = 1 mm (LS = simplex lobulus; PML = paramédiane lobule; COP = copule pyramidis).

Figure 3. CART A. est exprimée en escalade terminaux de fibres dans la couche moléculaire. Échelle = 100 um. (Ml = couche moléculaire; pcl = couche de cellules de Purkinje; gl = couche granulaire) B. Wholemount immunohistochimie de l'expression CART dans le néo-zélandais. La barre d'échelle = 2 mm (COP = copule pyramidis; PML paramédian = lobule; PFL = paraflocculus; FL = flocculus).

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Discussion

Nous avons décrit les détails techniques nécessaires pour la coloration wholemount succès en utilisant une approche polyvalente immunohistochimique pour l'expression des protéines dans le cerveau révélateur en développement et les adultes. En utilisant cette approche, des motifs complexes moléculaires d'expression peut être analysée et la topographie du cerveau apprécié sans la nécessité de laborieuses et consommatrices de temps les procédures de sectionnement des tissus.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériels	Fonction dans le protocole
Pompe à perfusion (Fisher Scientific/13-876-2)	Permet de perfusion constante et lente.
Sharp-tip Ciseaux (FST/14081-08)	Utilisation générale de la perfusion et la dissection.
Blunt-tip forceps (FST/91100-12)	Pour stabiliser le coeur pour l'insertion de l'aiguille de perfusion.
Pince (FST par Dumont AA/11210-10)	Pour utilisation lors de la dissection du cerveau du crâne et de séparer du cervelet du reste du cerveau. Ces éléments sont essentiels parce qu'ils ont une extrémité légèrement arrondie qui permet de minimiser les dommages au cervelet lors de la dissection.
Nutator (Fisher Scientific)	Utilisé pour conserver des tissus en mouvement pendant les périodes d'incubation.
Tube de 1,5 ml (Sarstedt / Vis Micro Tube)	Toutes les étapes du sontochemistry protocole ont lieu dans ces microtubes. Le fond arrondi assure que le cervelet reste en mouvement.
Cuillère perforée (FST/10370-17)	Utilisé pour conserver des échantillons entiers dans les microtubes tout en douceur décantation la solution passé.
Leica MZ16 FA microscope	Utilisé pour examiner la coloration wholemount.
Leica DFC3000 FX caméra	Utilisé pour capturer des images wholemount.

Calendrier Exemple pour une expérience typique wholemount
Jour 1	Dent de correctifs, la température ambiante, 8 heures				Dent eau de Javel, 4 ° C, durant la nuit
Jour 2	100%, MeOH température ambiante, 2x, 30 minutes chacun			100% de MeOH, au gel / dégel, 4x, 30 min/15 min			n = "2"> 100% MeOH, -80 ° C, pendant une nuit
Jour 3	50% MeOH/50% PBS, la température ambiante, 60-90 min	15% MeOH / 85% de PBS, la température ambiante, 60-90 min		100%, PBS température ambiante, 60-90 min		10μg/mL protéinase K dans du PBS, la température ambiante, 2-3 min	100%, PBS température ambiante, 3x, 10 min à chaque fois	PMT, 4 ° C, durant la nuit
Jour 4-5	PMT + 1 ° d'anticorps + 5% DMSO, 4 ° C, 48 h
Jour 6	PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 heures chaque			PMT + 2 ° anticorps + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 heures (ou commencer étapes d'amplification avec ABC complexe)
Jour 7	PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 heures chaque		PBT, la température ambiante, 2 heures			Incuber en DAB frais dans du PBS jusqu'à coloration optimale est visualisée

Recettes (* = préparer une nouvelle à chaque fois)
PBS (tampon phosphate salin)	0,1 M de tampon phosphate salin dans de l'eau désionisée. pH 7,2 (Sigma comprimés; P4417)
PFA (paraformaldéhyde)	Fabriqué et congelés stockés comme une solution à 20%, puis on dilue à 4% dans du PBS pour la solution de travail (Fisher Scientific, T353)
Fixation de Dent 3 *	4 parties de méthanol 1 diméthylsulfoxyde partie (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent Bleach 3 *	4 parties de méthanol 1 diméthylsulfoxyde partie (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 partie de peroxyde d'hydrogène 30%
Digestion enzymatique	10 pg / ml de protéinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) dans du PBS.
PBST	PBS contenant: 0,1% de Tween-20 (Fisher scientifique, BP337; Triton peut également être utilisé à la place de Tween-20 dans tous les cas).
PMT 25 *	PBS contenant: 2% de poudre écrémé lait écrémé (Carnation préféré) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337)
PBT 25 *	PBS contenant: 0,2% de sérum albumine bovine (Sigma; B9001S) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337)
DAB *	Dissoudre un comprimé de 10 mg de 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) dans 40 ml de PBS. Ajouter 10 ul de peroxyde d'hydrogène à 30% pour initier la réaction).
ABC solution complexe	Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000)