Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l'imagerie calcique

Résumé

Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l'activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d'utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l'intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.

Résumé

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des deux zones neurogènes dans le cerveau postnatal. La SVZ contient des cellules très denses, y compris les cellules progénitrices neurales avec des caractéristiques astrocytaires (appelées astrocytes SVZ), neuroblastes, et les cellules progénitrices intermédiaires. Neuroblastes nés dans la SVZ tangentiellement migrer une grande distance vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en interneurones. Signalisation intercellulaires par l'intermédiaire des molécules d'adhésion et de signaux diffusibles jouent un rôle important dans la neurogenèse contrôle. Beaucoup de ces signaux déclencher l'activité de calcium intracellulaire qui transmet l'information à l'intérieur et entre les cellules. L'activité de calcium est donc le reflet de l'activité des signaux extracellulaires et est un meilleur moyen de comprendre fonctionnelle signalisation intercellulaire entre les cellules SVZ.

L'activité de calcium a été étudiée dans de nombreuses autres régions et types de cellules, y compris les astrocytes et les neurones matures. Cependant, la méthode traditionnelle de loacellules d avec indicateur de calcium colorant (chargement de bain par exemple) n'était pas efficace pour le chargement de tous les types de cellules SVZ. En effet, la densité cellulaire dans la SVZ empêche la diffusion de colorant dans le tissu. En outre, la préparation de coupes sagittales sera mieux préserver l'agencement tridimensionnel de cellules, en particulier SVZ le flux de migration neuroblaste sur l'axe rostro-caudal.

Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer des coupes sagittales contenant la SVZ, le chargement des cellules SVZ avec colorant indicateur de calcium, et de l'acquisition de l'activité de calcium avec time-lapse films. Nous avons utilisé Fluo-quatre heures colorant pour le chargement astrocytes SVZ l'aide de l'application de pression à l'intérieur du tissu. L'activité de calcium a été enregistrée à l'aide d'un microscope confocal à balayage permettant une résolution précise pour distinguer les cellules individuelles. Notre approche est applicable à d'autres zones neurogènes y compris la zone sous-granulaire de l'hippocampe et des adultes embryonnaires zones neurogènes. En outre, d'autres types de colorants peuventêtre appliqué en utilisant le procédé décrit.

Protocole

1. Préparation des solutions, Dissection, et Vibratome

1. Les solutions doivent être préparées à l'osmolarité et le pH correct (tableau 1). Par rapport au liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), la solution de dissection est préparé avec de faibles concentrations de sodium et de calcium, et de fortes concentrations de magnésium. Il s'agit de minimiser les effets excitotoxicité pendant le tranchage.
2. Les deux solutions de dissection et ACSF doit être saturée avec 95% O _2/5% de CO ₂ par barbotage pendant au moins 10 minutes pour atteindre le pH désiré de 7,3.
3. Préparer un bain de glace sur un plateau. Placez une plaque de dissection dans le bain de glace et remplir avec une solution de dissection. Bubble la plaque de dissection.
4. Préparer le vibratome en créant un bain de glace. Placer le plat de sectionnement dans le bain de glace, remplir la cuve avec une solution de dissection, et la bulle.
5. Remplissez la tranche chambre de retenue avec ACSF et la bulle afin d'assurer que la solution soit suffisamment aéré quel que soitoù des tranches sont placées.

2. Élimination des tissus cérébraux

Tranches cérébraux aigus ont tendance à être en meilleure santé avec de jeunes souris. L'architecture cellulaire SVZ postnatale à des rongeurs est mature vers le jour postnatal (P) 20 ^1. Par conséquent, nous essayons de limiter nos expériences à l'âge de la souris P20-P30, mais nous avons réalisé des expériences réussies chez des souris aussi vieux que 3 mois. Tout au long de la manipulation des tissus, il faut se garder de minimiser les mouvements mécaniques et de la pression dans le cerveau, maintenir des conditions de refroidissement, et d'exposer la SVZ à la solution le plus rapidement possible suivant sacrifice.

1. Après l'injection de pentobarbital, la souris est rapidement décapité. La fourrure est enlevée et les incisions sont faites à travers la base du crâne. La tête est ensuite placé dans un bac rempli d'une solution de dissection.
2. Alors que la stabilisation de la tête avec une pince, les coupes continues sont faites autour du crâne et parfois jusqu'à la ligne médiane avec Microscissors. Attention pour minimiser le contact avec le tissu. Depuis le bulbe olfactif est la destination finale des nouveaux neurones de la SVZ, il faut tenir compte de la préservation de cette région, en particulier lors de l'enlèvement des os autour de cette zone. Microscissor coupes faites autour du crâne doit être sur la face dorsale, afin de permettre un retrait facile du crâne.
3. Suppression du crâne recouvrant le cerveau est maintenant séparé de l'os sous le cerveau. Si des coupes dans l'étape précédente sont faites correctement, cet os sus-jacente peut être enlevé facilement avec des ciseaux ou des pinces.
4. Tout en maintenant la tête avec une pince, on peut utiliser une lame chirurgicale pour enlever proprement plusieurs morceaux de tissu cérébral avant le tranchage, telles que les suivantes. Une coupe coronale peuvent être faites au niveau du lambda. Coupes sagittales peuvent être faites sur les deux côtés du cerveau en dehors de la SVZ. Une estimation prudente serait ~ 2,5 mm de la ligne médiane. Si vous le souhaitez, le cerveau peut aussi être hemisected ici. Ces réductions seront tous deux faciliter le montage du tissu et permettre la SVZ être atteint plus rapidement lorsque le cerveau trancher. Il est important de se rappeler d'exercer le minimum de forces mécaniques sur le cerveau (par exemple ne pas pousser ou tirer).

3. Aiguë Préparation de tranches de cerveau

1. Pour préparer les étapes suivantes, s'assurer que la super glue utilisé pour monter le tissu est exempt de sabots et prêts à appliquer à la plaque vibratome. Il est important d'aller aussi vite que possible sans endommager le cerveau.
2. Le tissu cérébral peut alors être ramassé par le dessous, qui sépare le tissu de l'os sous-jacent, tout en séparant les nerfs.
3. Le tissu est monté et collé sur une plaque et placé sur le vibratome. En raison de l'anatomie rostro-caudale de la SVZ, nous nous sommes concentrés sur les coupes sagittales faire car il préserve la voie migratoire des neuroblastes, la gaine gliale, et la vascularisation qui sont en grande partie alignée dans cette direction. On peut soit moUNT du tissu ou sur la ligne médiane de la surface plane créée par des coupes sagittales latérales de la SVZ. Une étape facultative consiste à placer un bloc de 3% d'agarose derrière le tissu à servir de butée à la lame lorsque les tranches se détacher. Nous utilisés de préférence à base de cyanoacrylate super glue.
4. Rincer la lame avec de l'éthanol pour éliminer les huiles et rincer avec de l'eau distillée. Placer la lame sur le porte-lame. Monter le support de lame à la vibratome.
5. Réglez les paramètres vibratome pour couper le tissu avec une épaisseur de 250-350 um par tranche. Il est important de couper l'aide de vibrations à haute fréquence et à basse vitesse.
6. Section progressivement à travers le tissu. L'apparition du bulbe olfactif est un bon indicateur que l'on est près de la SVZ en coupes sagittales que les tranches les plus latérales contiendront aucune des deux régions. Autres sites à surveiller comprennent le ventricule et l'épaississement du corps calleux, sous laquelle se trouve la SVZ. La SVZ apparaissent en premier dans sagit latérale plustranches mentales. Le RMS apparaîtra dans coupes sagittales médianes.
7. Retirer les tranches contenant la SVZ avec une pipette Pasteur en plastique avec la pointe coupée. Transfert vers la chambre de retenue tranche. Nous avons souvent obtenir plus de tranches que nous pouvons utiliser dans une journée de travail. Cependant, tranches varie de la quantité de cellules contenant la SVZ. Il est parfois nécessaire de regarder à travers plusieurs tranches de trouver celui qui vous intéresse pour l'imagerie.

4. Préparation du microscope et colorants

Les tranches besoin d'un temps d'incubation d'une heure dans ACSF à se remettre de la dissection et de tranchage. Plusieurs mesures peuvent être effectuées au cours de cette période de récupération tranche.

1. Préparation de pipettes pour la teinture de calcium et / ou demande de drogue
   1. Pipettes en verre doivent avoir un bout de 2-3 um de diamètre et d'une longueur de pointe (~ 2 mm) et angle (~ 16 ° pour le porte-pipette) qui empêche le contact avec la chambre de perfusion et laisse de la place pour le placement del'objectif.
   2. On peut généralement préparer 6-8 pipettes de pression pour chaque jour d'expériences.
2. Préparation de colorant Calcium
   1. Lors de la préparation de la solution de travail (4-5 uM de bain, 250 uM par application de pression), il est préférable d'exposer le minimum de DMSO pour les cellules. Ceci peut être réalisé en faisant des stocks hautement concentrées. Par exemple, pour Fluo-4, un tube contenant 50 ug par jour est utilisée. On peut faire un stock de 10 mM de cette aliquote en ajoutant 4,6 pi de solution de Pluronic F-127 à 20% dans le DMSO.
3. Préparation de l'installation microscope (Figure 2).
   1. Utilisation d'une pompe péristaltique pour écoulement de la solution a permis de réduire la dérive d'image. Faites fonctionner la pompe péristaltique avant de permettre ACSF à courir à travers les lignes de perfusion et de s'assurer qu'il est exempt de bulles.
   2. Réglez l'entrée du tube de la chambre de perfusion et de s'assurer qu'il n'y ait pas de fuites.
   3. Positionner la pointe vide pour ensure que la solution est aspirée de la chambre de perfusion. Assurez-vous qu'il est à un niveau suffisant pour que l'objectif est immergé à la bonne distance de travail, mais pas assez élevée pour que la solution peut se répercuter sur la chambre. Un faible niveau de solution permettra également de minimiser les distorsions de flux. Une aspiration constante peut également être vérifié par l'écoute de solidité.

5. Colorant de charge

Cette méthode a été décrite en détail dans un autre manuscrit ^2. S'il vous plaît voir les figures ci.

1. Colorant de chargement Bath
   1. Faire une solution de 1-2 ml de travail de la teinture. Pour Fluo-4 AM, une concentration de 5.4 uM est adéquate pour l'étiquetage neuroblastes SVZ.
   2. Les tranches sont d'abord transférés à une boîte de culture de 35 mm avec un fond grillagé qui est déjà rempli avec ACSF. Remplacer la solution à l'aide d'une pipette en plastique 3 ml de transfert pour retirer doucement le ACSF, tout en ajoutant simultanément le calcium colorant la solution de travail.
   3. Incuber à 37 ° C pendant 30-60 min dans un groupe CO ₂ 5% de gaz commandé par l'environnement.
   4. Placez la tranche de retour dans la chambre ACSF remplie de tenir à laver colorant qui n'a pas pénétré dans les cellules. Alternativement, on peut le placer directement sur la chambre de perfusion microscope qui exécute ACSF. Cette période de lavage est 30-45 min.
   5. Transférer la tranche de la chambre de perfusion.
2. Application d'une pression de colorant
   1. Transférer la tranche à partir de la chambre de retenue à la chambre de perfusion sur la configuration de microscope.
   2. Remplir une pipette en verre avec une solution de travail qui est de 250 uM et le placer sur le micromanipulateur.
   3. Abaisser la pipette de la région d'intérêt. La pipette peut être placé de telle sorte que la pointe soit quelques micromètres au-dessus de la surface de tranche enterrée ou plusieurs micromètres en dessous de la surface de la tranche, mais à l'écart de la région enregistrée. L'angle de la pipette n'a pas affect l'efficacité du chargement. Quand l'imagerie en dessous de la surface de la tranche, nous constatons que de placer la pointe de pipette ci-dessous le plan d'imagerie va marquer notre zone d'imagerie souhaité mieux.
   4. Lorsque le colorant d'application de pression, fixé au Picospritzer de sorte qu'il est <3 psi. Nous n'avons pas estimé le volume de diffusion des colorants, parce que c'est sujettes à la variabilité du diamètre pointe de la pipette, la pression appliquée, et la densité du tissu où le colorant est injecté. Nous appliquons simplement jusqu'à ce que nous atteignons notre charge désirée telle qu'évaluée par l'œil. Minimiser les dommages à la tranche lors de l'application, en particulier lorsque la pointe est placée au-dessous de la surface de la tranche. Appliquer pendant 1-2 min. Parfois, des applications répétées sont nécessaires en fonction de l'étiquetage tel qu'évalué par l'œil. Pendant cette durée de concentration et d'application, nous constatons que l'application de surface de colorant qualifie de préférence neuroblastes en dessous de la surface d'application étiquettes préférentiellement les astrocytes. Cependant, l'application> 3 min à 500 uM également étiqueter les neuroblastesindépendamment du fait que la pointe se trouve au-dessus ou en dessous de la surface de la tranche (JC Platel, observation non publiée). Permettre de lavage et de récupération tranche pendant 30-45 min.

6. Imagerie confocale de l'activité de calcium

1. Trouver la première région d'intérêt avec un objectif à faible puissance telles que 4x ou 10x. Placez au centre du champ avant de passer à un objectif de puissance plus élevée. À ce stade, on peut évaluer la santé générale par tranche de noter l'apparition de cellules SVZ en vertu contraste d'interférence différentiel (DIC). Les cellules saines apparaissent rond et dodu. En outre, les cellules saines affiche faible Fluo-4 de chargement censé aucun chargement à fluorescence tout ou lumineux (une cellule de mourir).
2. Abaisser l'objectif à immersion dans l'eau sur la région d'intérêt, qui est maintenant chargé de colorant. Soit un objectif 40x ou 60x a été adapté à nos besoins, bien que 40x offre un large champ de vision et permet un accès plus pipette. Quand l'imagerie en dessous de lasurface, nous allons souvent au moins 15 um en dessous de la surface de la tranche où l'architecture 3-dimensionnel et la santé des cellules sont mieux conservées.
3. Vérifiez que la perfusion et le vide sont adéquatement.
4. Configurez le microscope de manière à ce que la résolution time-lapse et la résolution spatiale sont mis à taux souhaités. Pour la microscopie confocale, ces facteurs doivent être soupesés par une augmentation de la résolution temporelle se traduit généralement par une perte de résolution spatiale en raison de la nature de balayage du système. Pour l'activité calcique, nous avons imagé d'un cadre à peu près chaque seconde avec une résolution de 512x512 pixels. Si plusieurs canaux acquises séparément sont nécessaires, cela va aussi affecter les taux d'acquisition. Régler la durée de film (2-10 min).
5. Initier courir. Si la réalisation d'études pharmacologiques, lavis sur des antagonistes ou des agonistes non désensibilisation pendant au moins 5-10 minutes, puis faire un autre film de 5-10 min. Agonistes qui peuvent désensibiliser les récepteurs peuvent être extrêmement appliquée, par exemple en utilisant un prEssure pipette contrôlée par un micromanipulateur.

7. Analyse de calcium

Analyse suit les procédures standard que nous avons décrits dans les publications perméables ^2-4. F ₀ (référence exemple) et F sont les intensités moyennes de fluorescence mesurées dans l'ensemble des régions d'intérêt (ROI) et dans chaque ROI, respectivement. Un changement de la fluorescence a été considérée comme une augmentation de Ca ^{2 +,} si elle était> 15% F / F ₀ augmentation. Intracellulaires de Ca ^{+ 2} modifications ont été calculés en utilisant Calsignal ^5.

8. Les résultats représentatifs

Nous avons pu obtenir chargement sélectif de cellules SVZ selon les protocoles de chargement colorant décrites ci-dessus et ailleurs ^2-4,6. Chargement baignoire ou application d'une pression sur la surface de la tranche de Fluo-quatre heures (4-5 ou 250 pM, respectivement) pour la plupart des étiquettes neuroblastes. Bien que l'application de pression peut charger neurobdure plus rapidement que le chargement de bain en une seule tranche, le chargement bain permet le chargement simultané de plusieurs tranches. Nous confirmons l'identité des cellules marquées que par les neuroblastes (1) si elles affichent un comportement migratoire ^4,7, (2) leur morphologie, (3) coloration négative de sulforhodamine 101, un colorant spécifique des ^astrocytes-3 ou (4) une coloration positive avec DCX-DsRed expression (JC Platel, observation non publiée). Neuroblastes migrent rapidement (en moyenne 60 um / h) à température physiologique ^4,7-9, mais leur mouvement peut être facilement observée même à température ambiante. Le mouvement des neuroblastes ne pose pas un problème en ce qui concerne la mise régions d'intérêt (ROI) pour suivre l'activité de calcium puisque nos films sont généralement de courte durée. Cependant, au cours de longues périodes d'attente, comme lors des échanges de solutions de médicaments, les enquêteurs doivent faire attention à faire correspondre ROI dans le contrôle et périodes de traitement. Il n'est pas rare pour les neuroblastes de migrer dans ou hors de l'i domaine de forgemagie ou plan focal.

Application de la pression de Fluo-4 AM (250 uM) de profondeur dans la tranche et pour une durée limitée (<2 min) qualifie préférentiellement les astrocytes SVZ ^2. L'étiquetage des astrocytes a été vérifiée par marquage positif avec sulforhodamine 101 et leur morphologie, en particulier par la présence de projections et endfeet sur ​​les vaisseaux sanguins que nous avons récemment décrits ^3. En utilisant ces méthodes, nous avons observé une activité spontanée dans les deux neuroblastes SVZ et de la population d'astrocytes (Figure 1). L'activité dans les astrocytes prend souvent la forme d'ondes qui se livrent ³ vaisseaux sanguins. En outre, en utilisant l'imagerie de calcium en tant que test, l'application d'agonistes pharmacologiques ont révélé ou confirmé l'expression des récepteurs GABA _A sur les neuroblastes et les astrocytes ^6, AMPA et NMDA récepteurs des neuroblastes ^4.

Chiffres

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Figure 1. Propager l'activité de calcium dans les astrocytes. (A) représentant en moyenne l'image d'un enregistrement time-lapse de l'activité de calcium. Astrocytes dans la SVZ étaient chargés de l'application de la pression Fluo-quatre heures dans la tranche de profondeur. Films ont été acquises à 0,75 s temps-étapes. Régions d'intérêt (ROI) sont placés sur des cellules présentant une activité. (B) Les traces de régions d'intérêt placé au-dessus des cellules du film décrit en (A). Des traces ont été filtrés avec une moyenne mobile et normalisée. L'échelle verticale représente 2 x AF / F _0, où F est l'intensité de signal et F ₀ est le signal de référence moyen et AF = ₀ FF.

Figure 2. Image du système de perfusion. Une extrémité d'un tube est immergé dans 95% ₂ O / 5% de CO ₂ gaz-perfused solution. La solution est alors perfusé à travers le tube et dans la chambre de bain par une pompe péristaltique (non représentée). L'autre extrémité est insérée dans l'entrée de la solution de bain de la chambre montée sur une plate-forme. Le bec d'aspiration est alors reliée à la sortie de la solution de la chambre et fixé à un niveau pour déterminer la hauteur solution. À partir de la sortie, le bec d'aspiration est reliée à la canalisation à vide, qui aspire la solution de la chambre dans un récipient à déchets. Le système de perfusion est mis en valeur la platine du microscope pour la clarté visuelle.

Discussion

Imagerie calcique des cellules SVZ a été utilisé pour étudier les tendances de l'activité spontanée dans les neuroblastes ^10, l'expression du récepteur de canal dans les deux neuroblastes et les astrocytes et des vagues de calcium ^4,6,8 astrocytaires ^3. Comme les cellules de la SVZ sont soit immatures ou ayant des propriétés gliales, ils ne se déclenche pas d'action potentiels ^11,12, ce qui signifie que les changements dans milliseconde potentiel de tensi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluté	Entreprise	Numéro de catalogue	Dissection (mM)
Saccharose	Sigma	S0389	Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM
NaCl	Sigma	S9888	Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM
KCl	Sigma	P3911	Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM
MgCl 2 .6 H 2 O	Sigma	M9272	Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM
NaH 2 PO 4. H 2 O	Sigma	S8282	Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM
Glucose	Sigma	G8270	Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM
NaHCO 3	Sigma	S6014	Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM
CaCl 2 .2 H 2 O	Sigma	C3306	Dissection: 1,33 mm ACSF: 2 mM

			[En-tête]
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vibratome	Leica	VT 1000S
Super Glue	Surehold ou 3M	Surehold 3G Super Glue ou 3M Vet-Bond
Outils de dissection	Roboz ou Ted Pella
Fluo-quatre heures sensible au calcium colorant	Invitrogen	F14201
Oregon Green BAPTA-une heures de calcium colorant sensible	Invitrogen	O6807
Solution Pluronic F-127 20% dans du DMSO	Invitrogen	P3000MP
Upright microscope confocal	Olympe	FV300 FV1000 ou
L'eau d'immersion objectifs	Olympe	LUMPlanFl 40 x L / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90)
Micromanipulateurs	Sutter	MPC-200/MPC-325/MPC-385
	Parker Hannifin	Picospritzer	<3 psi pendant l'application
Pipette extracteur	Sutter ou Narshige	Sutter P-97 ou Narshige PP-830
Pipettes en verre	Sutter	BF150-110-10	Identification: 1,10, OD: 1,50
Pompe péristaltique	Harvard Apparatus	Modèle 720	débit: 1 ml / min
Bain Chambre	Warner Instruments	RC-26 BPL	Profil bas permet un dégagement objectif
Tubes	Tygon
Contrôleur de température	Warner Instruments	TC-324B/344B