Un test galvanotaxie pour l'analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l'extérieur électrique à courant continu

Résumé

Dans ce protocole, nous allons montrer comment construire des chambres personnalisées qui permettent l'application d'un champ électrique à courant continu pour permettre imagerie time-lapse de cerveau adulte dérivé de neurones translocation cellule précurseur pendant galvanotaxie.

Résumé

La découverte des cellules souches et des cellules progénitrices neurales (collectivement appelées cellules précurseurs neurales) (PNJ) dans le cerveau des mammifères adultes a conduit à un ensemble de recherches visant à utiliser les propriétés multipotentes et de prolifération de ces cellules pour le développement de stratégies neuroregenerative. Une étape cruciale pour le succès de ces stratégies est la mobilisation des PNJ vers un site de lésion consécutive à une transplantation ou exogène pour améliorer la réponse des précurseurs endogènes que l'on trouve dans la région périventriculaire du système nerveux central. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes qui favorisent, d'orienter et d'améliorer la migration PNJ. Notre travail se concentre sur l'utilisation du courant continu champs électriques (dcEFs) de promouvoir et de migration directe PNJ - un phénomène connu sous le nom galvanotaxie. Endogènes physiologiques des champs électriques fonctionnent comme des repères essentiels pour la migration cellulaire au cours du développement normal et la cicatrisation des plaies. La perturbation pharmacologique dutension du tube neural chez trans-embryons axolotl provoque de graves malformations du développement ^1. Dans le contexte de la cicatrisation, le taux de réparation de la cornée blessés est directement corrélée à l'ampleur du potentiel de blessure épithéliale qui se pose après une blessure, comme le montre l'amélioration pharmacologique ou l'interruption de ce dCEF ^2-3. Nous avons démontré que les adultes subissent PNJ sous-épendymaires rapide et dirigé la migration cathodique in vitro lorsqu'elles sont exposées à un dCEF appliqué de l'extérieur. Dans ce protocole, nous allons décrire les techniques de notre laboratoire pour la création d'un test galvanotaxie simple et efficace à haute résolution, observation à long terme de la translocation de cellule du corps dirigé (migration) sur un seul niveau de cellules. Ce test serait approprié pour étudier les mécanismes qui régulent la transduction dCEF dans la motilité cellulaire grâce à l'utilisation de souris transgéniques ou knock-out, courts ARN interférents ou des agonistes / antagonistes des récepteurs spécifiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant la manipulation des animaux ont été approuvés par l'Université de Toronto Comité de protection des animaux, conformément aux directives institutionnelles (protocole n °. 20009387). Les méthodes suivantes doivent être effectuées à l'aide des outils et des techniques stériles, dans une hotte à flux laminaire, le cas échéant.

Dans le texte du protocole ci-dessous, l'expression «EFH-SFM» se réfère à un milieu sans sérum supplémenté avec facteur de croissance épidermique, le facteur de croissance des fibroblastes et l'héparine. EFH-SFM est utilisé lorsqu'il examine la galvanotaxie de PNJ indifférenciées parce que ces mitogènes maintenir PNJ dans leur ⁴ état ​​indifférencié. Lorsque l'on étudie la galvanotaxie de PNJ induites à se différencier en types de cellules matures, "FBS-SFM» se réfère à un milieu sans sérum supplémenté avec 1% de sérum de veau foetal. FBS favorise la différenciation des PNJ dans les phénotypes neuraux matures ^5.

1. Isolement et culture des précurseurs neuronaux (Nonmontré dans la vidéo)

1. Anesthésier la souris CD1 (6-8 semaines) avec isofluorane et le sacrifice par dislocation cervicale.
2. Arrosez la tête dans l'éthanol à 70% et décapiter l'animal avec des ciseaux pointus dissection.
3. Tout en maintenant la tête avec une pince chirurgicale, enlever la peau sur la surface dorsale pour exposer le crâne.
4. L'aide d'un scalpel et non. 11 lames, marquer le crâne au niveau du sinus frontal dans l'axe médio-latéral, et aussi le long de la suture sagittale dans le sens rostro-caudal.
5. Peler les os pariétaux loin de la tête sans. 7 pinces courbes, en prenant soin de ne pas percer le tissu cérébral.
6. Insérez une spatule mince en dessous du cerveau à partir de sous le cervelet et avancer vers les bulbes olfactifs. Tout en tenant le crâne en place avec une pince, tirez doucement sur le cerveau du crâne et placez-la immédiatement dans de la glace-froid liquide céphalo-rachidien artificiel (voir les recettes ci-dessous).
7. Sous un microscope de dissection, en utilisant stériledes ciseaux et des pinces à dissection couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane. Tournez chaque hémisphère de sorte que la médiane (couper) la surface orientée vers le haut.
8. Sélectionnez un hémisphère, et avec la surface interne tournée vers le haut, localisez le bourrelet du corps calleux (région postérieure du corps calleux).
9. Faire une incision de la surface du cortex pour le bourrelet du corps calleux long de l'axe dorso-ventral.
10. Peler le cortex incisée vers le bulbe olfactif pour exposer les parois médiale et latérale du ventricule latéral.
11. Tournez l'hémisphère sorte que la surface dorsale orientée vers le haut, et l'utilisation microciseaux courbes à découper et à recueillir les murs exposés médial et latéral, qui contiennent la région périventriculaire où résident les PNJ ^6.
12. Répétez les étapes 1.8 à 1.11 pour l'autre hémisphère.
13. Pipeter le tissu isolé dans 7 ml de solution de trypsine (voir recette ci-dessous) dans un tube de 15 ml, et placer le tube sur une bascule dans un 37 ° Cincubateur pendant 25 min.
14. Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension le tissu dans 2 ml de solution d'inhibiteur de trypsine (voir recette ci-dessous).
15. Doucement triturer le tissu avec un petit trou de forage pipette Pasteur 30-50 fois avec soin pour éviter les bulles d'air.
16. Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1-2 ml de GDF (voir recette ci-dessous) en triturant le culot 3-5 fois.
17. Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 3 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de GDF + EFH.
18. Comptez vivre densité cellulaire avec un hémocytomètre et la plaque des cellules dans un flacon T25 culture à une densité de 10 cellules par ml dans GDF + EFH.
19. Permettre à la culture de se développer pendant 7 jours non perturbées pour produire flottants neurosphères primaires composées de PNJ.

2. Galvanotaxie Chambre Préparation

1. Placez verre 3 carrés non. 1 lamelles (22 x 22 x 0,17 mm) ina bouteille d'acide chlorhydrique 6N pendant la nuit.
2. Le lendemain, utilisez un diamant à pointe de verre cutter pour couper 6 bandes rectangulaires (22 x 5 x 0,17 mm) de verre à partir de carré. 1 lamelles.
3. Transférez les bordereaux lavés à l'acide carrés et rectangulaires glisse dans une hotte à flux laminaire. Laver les barrettes rectangulaires et carrées d'abord avec l'éthanol à 70%, puis avec la culture de tissus de qualité de l'eau en autoclave, et laisser sécher sur une Kim Wipe (pour la stérilité ajouté, le verre peut être autorisé à air sec).
4. Appliquer de la graisse à vide à la périphérie d'une surface des lames de verre carrés, et les sceller à la base de boîtes de 60 mm de Pétri en plastique.
5. Appliquer de la graisse à vide le long de l'axe long d'une surface de la bande de verre rectangulaires, et les sceller aux bords opposés de la lame de verre carrés (de telle sorte qu'ils soient parallèles les unes aux autres), afin de créer un creux central.
6. UV-stériliser les chambres pendant au moins 15 min dans la hotte à flux laminaire.
7. Pipette 250-300 ul de poly-L-Lysine sur la cuvette centrale des chambres et incuber à température ambiante pendant 2 heures.
8. Environ 15 min avant la fin de la période d'incubation, préparer la solution de Matrigel (voir recette ci-dessous).
9. Aspirer le poly-L-lysine, se laver les bacs centrales avec 1 ml d'eau autoclave, et la pipette 250-300 ul de solution de Matrigel sur les creux central.
10. Incuber les chambres à 37 ° C pendant 1 heure.
11. Aspirer la solution de Matrigel et laver délicatement les creux central avec 1-2 ml de GDF.
12. Pipette 100 ul d'EFH-GDF ou FBS-GDF sur les creux central et transférer les chambres galvanotaxie sur la scène d'un comptage au microscope.
13. Pipette 3-4 ml de la culture contenant de neurosphères dans une boîte de Petri de 60 mm et transférer la boîte de Pétri à l'étape de comptage au microscope.
14. Un objectif de vision de 5x, utiliser une pipette P10 pour transférer 5-8 neurosphères entiers (jusqu'à quatre à la fois) sur la cuvette centrale de chaque galvanotaxiechambre sans les dissocier, et soigneusement répartis les neurosphères autour de la cuvette centrale, sans perturber le substrat Matrigel.
15. Ajouter un supplément de 150 à 200 pi d'EFH-GDF ou FBS-GDF sur les creux central.
16. Transférez les chambres galvanotaxie dans un 37 ° C, 5% de CO _2, 100% incubateur humidifié pour 17-20 heures (si l'analyse PNJ indifférenciées) pour permettre à l'neurosphères à adhérer au substrat Matrigel et se dissocier en cellules individuelles comme le montre la figure 1 . Si l'analyse de PNJ différenciés, la période d'incubation devrait être étendu aux 69-72 h pour permettre la différenciation des cellules.

3. Vivez cellulaire imagerie time-lapse

1. Permettre au système d'imagerie de cellules vivantes s'équilibrer à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant au moins 30 minutes avant le début de l'enregistrement time-lapse.
2. Coupez deux 12 pièces de 1 cm de diamètre mm Argent fil, bobine eux d'un bout, et les placer dans Clorox blixiviation pendant 20 min pour former électrodes Ag / AgCl.
3. Transférez les chambres galvanotaxie sur la scène d'un comptage au microscope et sélectionnez cette chambre sera utilisé pour des cellules vivantes analyse de la migration d'imagerie basée sur les critères suivants: i) les neurosphères devrait être presque complètement dissocié dans des cellules individuelles et ii) les cellules doivent posséder morphologies rondes avec petits-à-pas de processus qui s'étend des corps cellulaires.
4. Transférer la chambre galvanotaxie sélectionné dans une hotte à flux laminaire, avec un pas de carré séparé. 1 lamelle de verre et de graisse à vide.
5. Laver le capot coulissant première à l'éthanol 70%, puis avec de l'eau en autoclave, et à appliquer une bande de graisse à vide sur deux bords parallèles de la lamelle.
6. Aspirer les milieux de culture à partir de la goulotte centrale de la chambre, puis de placer rapidement la lamelle (graisse du côté orienté vers le bas) sur la chambre de telle sorte que le reste des bandes de graisse sur les deux bandes parallèles de verre rectangulaires, créant ainsi un toità la chambre.
7. Pipeter 100 pi de frais EFH-GDF ou FBS-SFM dans le creux central par capillarité.
8. Utiliser la graisse à vide pour créer des bordures pour les piscines de milieux de culture sur chaque extrémité de la goulotte centrale, comme représenté sur la figure 2.
9. Coupez deux 15 pièces cm de tuyau en PVC, et d'utiliser une seringue de 10 cc avec une aiguille de calibre 18 pour injecter la solution d'agarose soigneusement dans le tube, veiller à ce qu'aucune des bulles se forment dans les tubes, et laisser solidifier le gel pendant 5 min.
10. Transférer la chambre galvanotaxie pour le système d'imagerie de cellules vivantes, ainsi que le gel d'agarose à tubes, Ag / AgCl, et une paire de boîtes de Petri vides 60 mm qui sera utilisé comme milieu de culture et des réservoirs contient de l'Ag / AgCl. Permettre à la chambre galvanotaxie à reposer à l'intérieur de la 37 ° C, 5% CO ₂ environnement de 20-30 min.
11. Pendant ce temps, préparez les couvercles des boîtes de Pétri vides 2 et le couvercle de la boîte de Petri de la chambre galvanotaxie par des trous de forageen y dermiques ou un outil similaire à celui représenté sur la figure 3.
12. Pipette 1-1,5 ml d'EFH-GDF ou FBS-SFM sur chaque côté de la cuvette centrale, et 7-8 ml de la GDF dans chaque boîte de Pétri vide. Placez une boîte de Pétri de chaque côté de la cuvette centrale de la chambre galvanotaxie et placez un Ag / AgCl dans chaque boîte. Combler l'écart entre la chambre galvanotaxie et les boîtes de Pétri à établir une continuité électrique avec les ponts gel d'agarose, comme le montre la figure 4.
13. Connecter les électrodes Ag / AgCl à une alimentation externe, avec un ampèremètre en série pour mesurer le courant électrique, et allumez l'alimentation. Utiliser un voltmètre pour mesurer la force du champ électrique directement à travers la cuvette centrale, et ajuster le débit de l'alimentation en énergie jusqu'à ce que l'intensité du champ électrique souhaité est atteint (les dosages effectués dans ce laboratoire utiliser une résistance DCEF de 250 mV / mm courant électrique entre 1 et 1,5 mA).
14. Initiativete du module time-lapse sur le système d'imagerie de cellules vivantes, et de permettre l'expérience de courir pour la durée souhaitée. Après l'achèvement de l'essai, fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pour une analyse immunohistochimique standard.

Résultats

L'analyse cinématique révèle que, en présence d'une mesure de 250 mV / mm dCEF, les PNJ indifférenciées présentent galvanotaxie très rapide et dirigés vers la cathode (figure 5A, Film 1). En l'absence d'un dCEF, le mouvement aléatoire des cellules est observée (figure 5B, Film 2). A ce champ,> 98% des PNJ indifférenciées migrer pour la de 6-8 heures pour lesquelles ils sont imagés, et depuis les cellules mortes ne migrent pas ce qui suggère qu'ils r...

Discussion

Ce protocole a été adapté à partir des méthodes bien établies d'études antérieures ^7-9. Galvanotactic chambres peuvent être construits en utilisant une variété de techniques différentes, y compris la construction d'un verre séparé bien pour le confinement de l'ensemencement des cellules, ou par ablation laser CO ₂ pour la microfabrication de la cuvette centrale ^10,11. Certaines techniques peuvent être plus laborieux ou coûteux que d'autres. Nous avons déc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de l'objet	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			Neural Isolement de cellules précurseurs
2M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g dans 100 ml dH O 2
1M KCl	Sigma	P5405	7,456 g dans 100 ml dH O 2
1M MgCl 2	Sigma	M2393	20,33 g dans 100 ml dH O 2
155 mM NaHCO 3	Sigma	S5761	1,302 g dans 100 ml dH O 2
Glucose 0,5 M	Sigma	G6152	9,01 g dissous dans 100ml dH 2 O
108 mM de CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g dans 100 ml dH O 2
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15070
Trypsine pancréatique bovine	Sigma	T1005
Sheep testicules hyaluronidase	Sigma	H6254
L'acide Kynurenic	Sigma	K3375
Ovomucoïde inhibiteur de trypsine	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
Glucose à 30%	Sigma	G6152
7,5% de NaHCO 3	Sigma	S5761
HEPES 1M	Sigma	H3375	23,83 g dans 100 ml dH O 2
L-glutamine	Gibco	25030
FEM	Invitrogen	PMG8041	Reconstituer dans 1 ml de mélange d'hormones et aliquote en 20 unités ul.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstituer dans 0,5 ml de mélange d'hormones et aliquote en 20 unités ul.
L'héparine	Sigma	H3149
Apo-transferrine	R & D Systems	3188-AT	0,1 g dissous dans 4 ml dH 2 0
Putrescine	Sigma	P7505	Dissoudre 9,61 mg dans Apo-transferrine afinlution
Insuline	Sigma	I5500	Dissolvez 25 mg dans 0,5 ml de HCl 0,1 N et ajouter à 3,5 ml de dH 2 0
Sélénium	Sigma	S9133
La progestérone	Sigma	P6149
Outils de dissection standard	Outils Fine Science
Microscope à dissection	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxie Chambre Préparation
Carrés diapositives couvercle en verre	VWR	16004
Acide chlorhydrique 6N	VWR	BDH3204-1
Graisse à vide élevé	Dow Corning
60 mm boîtes de Pétri	Fisher Scientific	0875713A
La poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Décongeler et aliquote de 150 unités en pl
FBS	Invitrogen	10082139	N'utiliser que si induction de la différenciation PNJ, sinon utilisez GDF + milieux de culture EFH comme indiqué ci-dessus
Compter microscope	Olympe	CKX41
			Vivez cellulaire imagerie time-lapse
Fil d'argent	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
La chaleur inactivitéFBS ATED	Sigma	16140071
Tubes en PVC	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Javellisant	Clorox
Seringue de 10 cc	BD	309604
Aiguille 18 de calibre	BD	305195
Perceuse Dremel	Dremel	Modèle 750
Microscope inversé équipé humidifié, chambre incubé	Zeiss	Axiovert-200M
			Recettes Article Volume 2M NaCl 6,2 ml 1M KCl 0,5 ml 1M MgCl 2 0,32 ml 155mm NaHCO 3 16,9 ml Le glucose 1M 1 ml 108 mM de CaCl 2 0,09256 ml Pénicilline-streptomycine 1 ml L'eau autoclavée 74 ml Liquide céphalo-rachidien artificiel Article Volume ou de masse Liquide céphalo-rachidien artificiel 30 ml Trypsine pancréatique bovine 40 mg Sheep testicules hyaluronidase 22,8 mg L'acide Kynurenic 5 mg Solution de trypsine Article Volume ou de masse GDF 15 ml Ovomucoïde inhibiteur de trypsine 10 mg Solution inhibiteur de la trypsine Article Volume L'eau autoclavée 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml Glucose à 30% 2 ml 7,5% de NaHCO 3 1,5 ml HEPES 1M 0,5 ml Transferrine, putrescine solution 4 ml Une solution à 25 mg d'insuline 4 ml Sélénium 100 & mu; L La progestérone 100 pi Mix Hormone (100 ml au total, conserver à -20 ° C) Article Volume L'eau autoclavée 37,5 ml DMEM/F12 10X (3:1) 5 ml Glucose à 30% 1 ml 7,5% de NaHCO 3 0,75 ml HEPES 1M 0,25 ml Mélange hormone 5 ml L-glutamine 0,5 ml Pénicilline-streptomycine 0,5 ml Sérum Free Media EFH-GDF: ajouter 10 ul d'EGF, 10 pi de FGF, et 3,66 ul d'héparine FBS-GDF: ajouter 0,5 ml de FBS
Article	Volume
Matrigel	150 pi
GDF	3,6 ml

Article	Volume ou de masse
UltraPure Agarose	300 mg dans 10 ml ddH 2 0
GDF FBS inactivé chaleur	8 ml 2 ml